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    花生肽對半乳糖致大鼠肝損傷的抑制作用

    2011-10-18 04:17:08陳貴堂趙立艷綦國紅王歲樓
    食品科學 2011年5期
    關鍵詞:半乳糖肝細胞花生

    陳貴堂,趙立艷,趙 霖,綦國紅,李 博,王歲樓

    (1.中國藥科大學藥學院,江蘇 南京 210009;2.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,江蘇 南京 210095;3.中國人民解放軍總醫(yī)院營養(yǎng)科,北京 100853)

    花生肽對半乳糖致大鼠肝損傷的抑制作用

    陳貴堂1,趙立艷2,趙 霖3,綦國紅1,李 博1,王歲樓1

    (1.中國藥科大學藥學院,江蘇 南京 210009;2.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,江蘇 南京 210095;3.中國人民解放軍總醫(yī)院營養(yǎng)科,北京 100853)

    為研究花生肽對D-半乳糖誘導的大鼠化學性肝損傷的保護作用,將50只SD大鼠隨機分為5組(對照組、模型組、低中高劑量花生肽組),除對照組外,其余各組大鼠按其體質(zhì)量每天皮下注射D-半乳糖400mg/kg建立氧化損傷模型,同時3個花生肽組每天分別按200、500、800mg/kg的劑量灌胃,持續(xù)50d。檢測血清生化指標以及肝臟中脂褐素含量和抗氧化酶活力,并進行肝組織病理學鏡檢。結(jié)果表明,花生肽能明顯對抗氧化損傷大鼠血清中總膽汁酸的積累,抑制谷丙轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶活力的升高,提高肝臟中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活力,并能夠降低大鼠肝臟中的脂褐素含量,有效減輕大鼠肝臟的組織病理形態(tài)學變化。表明花生肽對D-半乳糖誘導的大鼠肝損傷有一定的保護作用。

    花生肽;肝損傷;D-半乳糖;保肝

    近十幾年來,源于食物蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中的生物活性肽引起了國內(nèi)外學者的高度關注,特別是具有延緩衰老作用的抗氧化肽已成為當前生物活性肽領域引人注目的研究方向之一,如魚蛋白多肽[1-2]、卵蛋白多肽[3]、乳蛋白多肽[4-5]、大豆多肽[6-7]以及花生多肽[8-10]等。近幾年,又有多項研究表明,這些抗氧化肽對半乳糖胺[11-12]、四氯化碳[13]及酒精[14-15]引起的小鼠急性肝損傷都具有一定的保護作用,并提示這些功能的實現(xiàn)可能主要依賴于其抗氧化活性。筆者也曾采用多種實驗方法評價了Alcalase酶解所得花生肽的抗氧化活性,結(jié)果表明花生肽無論在體外還是在動物體內(nèi)都具有很強的抗氧化能力[8-9]。為進一步研究花生肽在體內(nèi)的生理活性,本實驗采用D-半乳糖誘導的氧化損傷大鼠模型,通過灌胃給予模型大鼠不同劑量的花生肽,考察花生肽對D-半乳糖所致的大鼠亞急性肝損傷的保護作用,為花生抗氧化肽乃至花生餅粕蛋白的進一步開發(fā)應用提供實驗依據(jù),也有望為人們提供一種安全的保肝功能性食品,這對于肝炎病高發(fā)的國家來說,無疑是具有重要意義的。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    花生蛋白 市售;蛋白酶Alcalase2.4L 丹麥Novo公司;D-半乳糖(分析純) 中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司;超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;甲醛(優(yōu)級純) 北京化學試劑公司。

    1.2 儀器與設備

    中空纖維濾膜器 天津膜天膜工程技術(shù)有限公司;全塑動物代謝籠 自制;Hitachi7600全自動生化分析儀日本Hitachi公司;101-3E電熱鼓風干燥箱 上海實驗儀器廠有限公司;Lambda7紫外-可見分光光度計、Ls-5熒光光度計 美國P.E公司;Sartorius電子天平 德國哥廷根賽多利斯股份有限公司;LDZ5-2自動平衡離心機 北京醫(yī)用離心機廠;Model Bx51TF光鏡 日本Olympus Optical公司。

    1.3 實驗動物

    SPF級SD大鼠,雄性,50只,體質(zhì)量195~205g,由中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心提供。

    1.4 方法

    1.4.1 花生肽的制備

    以花生分離蛋白為原料,采用Alcalase2.4L 蛋白酶酶解,酶解條件為:pH7.5,溫度55℃,底物質(zhì)量濃度為8g/100mL,酶添加量為3%,在酶解過程中不斷加入1.0mol/L NaOH溶液使pH值保持恒定,水解時間為6h。酶解完畢后沸水浴3min使酶失活,立即冷卻,3000r/min離心10min,經(jīng)10kD中空纖維濾膜超濾,濾液濃縮后真空干燥即得花生肽。經(jīng)測定,該花生肽總氮含量達14.6%,其分子質(zhì)量基本在300~2600D范圍內(nèi),其中分子質(zhì)量在1000D以下的約占98.5%。

    1.4.2 動物分組及飼養(yǎng)

    將大鼠根據(jù)體質(zhì)量隨機分為5組,即對照組,D-半乳糖模型組,低、中、高劑量花生肽組,每組10只。除對照組外,其余各組大鼠按其體質(zhì)量每天皮下注射D-半乳糖400mg/kg,持續(xù)50d,對照組大鼠則每天皮下注射等量生理鹽水,花生肽低、中、高劑量組每天分別按200、500、800mg/kg的劑量灌胃,對照組及模型組用等量蒸餾水灌胃,每天稱其質(zhì)量1次。于空調(diào)動物實驗室內(nèi),在全塑代謝籠內(nèi)單獨飼養(yǎng),采用對喂法,保證實驗周期內(nèi)每只大鼠食物平均攝入量相等,自由飲用蒸餾水。環(huán)境參數(shù)為:溫度(23±1)℃,相對濕度(60±5)%,12h晝夜交替。

    1.4.3 樣品收集

    在第50天禁食12h后,大鼠斷頭取血,3000r/min離心15min分離出血清,用于生化指標的測定。解剖大鼠,迅速取出肝臟,生理鹽水沖洗干凈,用濾紙吸去水分,一部分用于臟器組織形態(tài)學觀察,一部分用預冷的生理鹽水制成10g/100mL勻漿,3000r/min低溫離心10min,取上清液進行SOD、GSH-Px和CAT活力以及脂褐素(LF)含量測定。

    1.4.4 檢測指標

    1.4.4.1 血清生化指標測定

    在分離出血清樣品24h內(nèi)用全自動生化分析儀檢測。檢測項目包括總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽固醇(TC)、總膽汁酸(TBA)、肌酐(Cr)含量和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、酸性磷酸酶(ACP)以及堿性磷酸酶(ALP)活力。

    1.4.4.2 肝組織中SOD、GSH-Px和CAT活力的測定

    SOD活力采用黃嘌呤氧化酶法進行測定,按測定試劑盒操作規(guī)程進行,以每毫克組織蛋白在1mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD活力單位(U);GSH-Px活力采用DTNB法測定,按試劑盒操作規(guī)程進行。以每毫克組織蛋白在37℃反應5min,扣除非酶促反應作用,使反應體系中GSH濃度降低1μmol/L為一個活力單位(U);CAT活力采用鉬酸銨法測定,取0.05mL經(jīng)生理鹽水稀釋的1g/100mL組織勻漿,按測試盒操作程序加入試劑,用0.5cm光徑比色杯測定其在405nm波長處的吸光度,根據(jù)公式計算CAT活力,以每毫升血清或每毫克組織蛋白每秒鐘分解1μmol的H2O2為一個活力單位(U)。

    肝組織中蛋白質(zhì)含量采用福林-酚法測定,以小牛血清白蛋白為標準。

    1.4.4.3 肝組織中LF含量測定

    參照衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003)規(guī)定方法略加修改進行測定。取肝組織約200mg左右,加入定量蒸餾水用勻漿器制成5g/100mL的組織勻漿,然后加入4.0mL于50℃預熱的氯仿-甲醇混合液(體積比2:1),用旋渦振蕩器充分混勻,3000r/min離心10min,此時樣品分為3層,上層為水相,中層為組織沉淀相,下層為氯仿-甲醇相。小心吸去上層水相,用帶長麻醉針頭的注射器沿試管壁穿過中層,將下層氯仿甲醇提取液吸出。然后再向提取液中加入甲醇0.2mL,輕輕振蕩混勻,使之清澈透明,置紫外燈下照射30s,倒入石英比色杯中,以0.1μg/mL的硫酸奎寧為標準對照,氯仿-甲醇混合液為空白,在狹縫4.4,靈敏度3.6,激發(fā)波長360nm,發(fā)射波長450nm(在此條件下,標準品的熒光強度為55~60),測定樣品的熒光強度。肝組織中LF含量按下式計算。

    式中:F0為樣品熒光強度;F1為空白熒光強度;F2為硫酸奎寧熒光強度;ρ為硫酸奎寧質(zhì)量濃度(0.1μg/mL);V為勻漿體積/mL;m為樣品質(zhì)量/g。

    1.4.4.4 臟器組織形態(tài)學觀察

    取大鼠肝臟,常規(guī)病理取材、福爾馬林固定、梯度濃度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋、切片、烤片、蘇木精-伊紅染色、脫水、透明、封片,光鏡下進行病理形態(tài)學觀察。

    1.5 統(tǒng)計分析

    2 結(jié)果與分析

    2.1 大鼠的生長狀況

    表1 花生肽對大鼠體質(zhì)量的影響(n=10)Table 1 Effect of peanut peptide on body weight of rats (n=10)

    在整個飼養(yǎng)期間,所有大鼠食欲良好,生長狀態(tài)正常,其體質(zhì)量變化如表1所示。各組大鼠初始平均體質(zhì)量基本相同,組間無顯著差異(P>0.05),給予不同的處理后,各組大鼠生長速度各不相同,其中對照組體質(zhì)量增加最快,模型組體質(zhì)量增加最慢,至第3周時二者體質(zhì)量達顯著差異。經(jīng)口服花生肽后,大鼠生長速度隨著多肽濃度的增加而增加,其中中、高劑量組大鼠體質(zhì)量增長速度在前4周基本與對照組平行,第5、6周有所減緩,第7周又開始加快,至第7周末其體質(zhì)量與對照組無明顯差異,而顯著高于模型組(P<0.05)。

    2.2 血清生化指標

    表2 大鼠血清生化指標測定結(jié)果(n=10)Table 2 Effect of peanut peptide on serum biochemical indexes in rats(n=10)

    從表2可以看出,TP、ALB、TC、Cr含量以及AST、ACP活力在各組之間均無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比,D-半乳糖致氧化損傷組大鼠血清TBA含量以及ALP、ALT活力顯著增高,而LDH活力顯著下降(P<0.05);與模型組相比,3個花生肽組,尤其是中、高劑量花生肽明顯抑制了TBA含量和ALP、ALT活力的升高(P<0.05),但對LDH活力影響不大(P>0.05)。

    2.3 肝臟SOD、GSH-Px、CAT活力和LF含量

    表3 花生肽對大鼠肝臟中SOD、GSH-Px、CAT活力及LF含量的影響(n=10)Table 3 Effect of peanut peptide on liver SOD, GSH-Px, CAT levels and LF contents in rats (n=10)

    從表3可以看出,與對照組相比,模型組以及中、低劑量花生肽組大鼠肝臟SOD、GSH-Px和CAT活力均顯著下降(P<0.05),模型組和低劑量花生肽組肝臟LF含量極顯著增加(P<0.01)。而與模型對照組相比,只有高劑量組大鼠肝臟SOD、GSH-Px和CAT活力顯著升高(P<0.05),而中、高劑量兩個花生肽組LF含量均顯著下降(P<0.05)。

    2.4 大鼠肝臟的組織形態(tài)學觀察

    圖1 大鼠肝組織的形態(tài)學比較 (×260)Fig.1 Histological change of liver tissues in rats (×260)

    通過鏡檢肝組織切片可以觀察到,對照組小鼠肝細胞索排列整齊,肝竇正常,肝小葉結(jié)構(gòu)與胞核結(jié)構(gòu)均較清晰(圖1a)。與對照組相比,模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)雖未見紊亂,但肝竇枯否細胞增生,匯管區(qū)小膽管增生,肝細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)多數(shù)小的脂質(zhì)空泡,部分肝細胞核固縮,胞漿紅染(圖1b)。低劑量花生肽組大鼠肝細胞胞漿內(nèi)脂質(zhì)空泡有所減少,但核固縮細胞還是較多(圖1c);中劑量花生肽組大鼠肝細胞胞漿內(nèi)脂質(zhì)空泡明顯減少,核固縮細胞也有所減少(圖1d);高劑量花生肽組大鼠肝細胞胞漿內(nèi)脂質(zhì)空泡明顯減少,核固縮細胞及胞漿紅染也明顯減少,肝竇枯否細胞無明顯增生,基本接近對照組(圖1e),組織病理學變化呈現(xiàn)出了良好的劑量-效應關系。

    3 討 論

    3.1 花生肽對大鼠體質(zhì)量以及肝功能的影響

    多數(shù)研究表明,實驗動物給予過量半乳糖后,生長遲緩,體質(zhì)量減輕[16],本實驗也得到了同樣的結(jié)果,但花生肽的補充有效地抵抗了大鼠體質(zhì)量的下降。

    血清總膽汁酸(TBA)是膽固醇在肝臟分解的代謝產(chǎn)物,由肝臟分泌到膽汁,用于脂肪的消化和吸收,因此與肝臟關系十分密切,當肝臟一旦發(fā)生實質(zhì)性損傷,肝細胞發(fā)生病變時,血清中TBA含量明顯升高。由表2可知,模型組大鼠血清TBA比對照組升高了1.2倍,說明D-半乳糖確實造成了大鼠的肝損傷,中、高劑量花生肽組大鼠血清TBA含量雖然顯著高于對照組,但卻明顯低于模型組,說明花生肽可在一定程度上減緩肝損傷。

    血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)與谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活力均可為肝細胞損傷和壞死的標志之一,它們活力的大小直接反映了肝細胞受損的程度。本實驗表明,半乳糖致氧化損傷大鼠血清ALT顯著高于對照組,進一步顯示了半乳糖對肝臟細胞的損傷作用。3個劑量的花生肽均能明顯對抗半乳糖致氧化損傷大鼠血清ALT的升高,表明花生肽確實能有效干預半乳糖所致肝細胞損傷,改善肝功能。

    堿性磷酸酶(ALP)幾乎存在于機體的各個組織,但以骨骼、牙齒、肝臟、腎臟含量較多。ALP經(jīng)肝膽系統(tǒng)進行排泄,所以當ALP產(chǎn)生過多或排泄受阻時,均可使血中ALP發(fā)生變化。當機體患有肝膽疾病,如阻塞性黃疸時,由于膽汁排泄不暢,會使ALP滯留于血中而增高,另外急慢性黃疸型肝炎或肝癌時也可使ALP升高。本實驗中,D-半乳糖致氧化損傷大鼠血清ALP活力顯著升高,表明其肝功能可能受損,而補充中、高劑量花生肽后有效抵制了血清ALP活力的上升,使其恢復到正常水平,再次顯示了花生肽保護肝功能的作用。

    乳酸脫氫酶(LDH)在所有組織中普遍存在,尤以肝、腎、心肌、骨骼肌、胰腺和肺中為最多。這些組織中的LDH活力比血清中高得多。所以當少量組織壞死時,該酶即釋放入血而使血液中LDH的活力升高。測定此酶常用于對心梗、肝病和某些惡性腫瘤的輔助診斷。但本實驗結(jié)果顯示,D-半乳糖致氧化損傷大鼠血清LDH活力顯著下降,補充花生肽后對LDH的活力沒有明顯影響,而關于LDH活力下降的臨床意義目前未見報道,所以其原因尚無法解釋。

    3.2 大鼠肝組織中LF含量和抗氧化酶活力的變化

    機體產(chǎn)生的氧自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸,引起脂質(zhì)過氧化反應,形成丙二醛(MDA)等脂質(zhì)過氧化物和新的氧自由基。MDA是脂褐素形成過程的中間產(chǎn)物,它能間接反映機體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平。大量實驗證明,氧化損傷時MDA水平或LF含量顯著升高。本項研究觀察了D-半乳糖誘發(fā)氧化損傷對大鼠肝組織脂褐素含量的影響,發(fā)現(xiàn)D-半乳糖可以誘發(fā)模型動物脂褐素沉積明顯增加。而補充高劑量花生肽(800mg/kg)后,可顯著降低肝臟LF含量,提示花生肽作為外源性的抗氧化物質(zhì),能夠促進機體產(chǎn)生內(nèi)源性抗氧化物質(zhì),清除自由基,抑制脂質(zhì)過氧化損傷。

    SOD、GSH-Px和CAT是體內(nèi)重要的酶抗氧化系統(tǒng),SOD能使超氧自由基歧化為氧氣和過氧化氫,CAT可使過氧化氫分解成為水和氧氣,GSH-Px可催化還原型的谷胱甘肽轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸偷墓入赘孰?,從而消除細胞中的有機或無機的過氧化物。本實驗結(jié)果表明,D-半乳糖致氧化損傷模型大鼠肝組織中SOD和GSH-Px和CAT活力均顯著降低,而3個劑量花生肽組能不同程度抑制肝組織中這些抗氧化酶活力的下降,其量效關系均呈正相關,提示花生肽具有清除氧自由基、活性氧及抗脂質(zhì)過氧化作用,因此可能對與自由基有關的疾病有防治作用。

    3.3 大鼠組織的形態(tài)學變化

    肝臟的形態(tài)學老化改變表現(xiàn)為肝實質(zhì)細胞數(shù)減少,肝再生功能減退;肝小葉容積變小,門管區(qū)纖維增加,肝動脈壁的纖維增厚;組織學肝細胞核的多倍性增加,肝臟出現(xiàn)巨大實質(zhì)細胞[17]。本研究結(jié)果顯示,D-半乳糖致氧化損傷大鼠的肝實質(zhì)細胞數(shù)雖未見明顯減少,但出現(xiàn)肝竇枯否細胞增生、匯管區(qū)小膽管增生、肝細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)多數(shù)小的脂質(zhì)空泡以及部分肝細胞核固縮和胞漿紅染等組織學特征,這可能與半乳糖的代謝產(chǎn)物在肝臟的損傷作用有關。低劑量花生肽組大鼠肝細胞胞漿內(nèi)脂質(zhì)空泡有所減少,但核固縮細胞還是較多;中劑量花生肽組大鼠肝細胞胞漿內(nèi)脂質(zhì)空泡明顯減少,核固縮細胞也有所減少;高劑量花生肽組大鼠肝細胞胞漿內(nèi)脂質(zhì)空泡和核固縮細胞及胞漿紅染均明顯減少,肝竇枯否細胞無明顯增生,表明花生肽對半乳糖所致肝損傷有一定的防護作用,這也與上述花生肽抑制大鼠血清TBA的積累以及抑制ALT和ALP活力增高的結(jié)果相符合。

    綜上所述,花生肽具有較強的抗氧化能力,并能有效地干預D-半乳糖所致大鼠的亞急性肝細胞損傷,但其保肝的藥理學作用機制還有待深入研究。

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    Hepatoprotective Effect of Peanut Peptide in D-Galactose-induced Liver Damage in Rats

    CHEN Gui-tang1,ZHAO Li-yan2,ZHAO Lin3,QI Guo-hong1,LI Bo1,WANG Sui-lou1
    (1. School of Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China;2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;3. Nutrition Department, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

    In order to explore the hepatoprotective effect of peanut peptide (PP) on D-galactose (D-Gal)-induced liver damage in rats, fifty rats were randomly divided into five groups designated as control group, model group and three PP-treated groups.Except for the control group, the other groups were subcutaneously injected with D-Gal solution at a daily dosage of 400 mg/kg for 50 successive days to establish oxidative damage model. Meanwhile, rats in PP treatment groups were orally administered with PP at dosages of 200, 500 mg/kg and 800 mg/kg, respectively. The biochemical index, lipofuscin (LF) content, and superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) and catalase (CAT) activities in liver were analyzed. In addition,histopathological characters in liver tissues were observed under a light microscope. The results showed that a D-Gal-induced rat model with liver damage was successfully established. PP significantly decreased the levels of TBA, ALT and ALP in serum and LF in liver, and obviously increased the levels of SOD, GSH-Px and CAT in liver in a dose-dependent manner. Furthermore, the histopathological characters of liver tissues in PP treatment group at high dosage were close to those in the control group.Therefore, PP has an excellent protective capability against liver damage in D-Gal-induced rats.

    peanut peptide;liver damage;D-galactose;hepatoprotective effect

    TQ936.16

    A

    1002-6630(2011)05-0296-05

    2010-06-29

    陳貴堂(1977—),男,副教授,博士,研究方向為食品營養(yǎng)化學與功能食品學。E-mail:caucgt@163.com

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