北五味子乙素清除自由基及體外抑菌作用的研究

李 斌，孟憲軍*，薛 雪，吳 倩，李元甦，汪艷群

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866)

北五味子乙素清除自由基及體外抑菌作用的研究

李 斌，孟憲軍*，薛 雪，吳 倩，李元甦，汪艷群

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866)

對(duì)五味子乙素進(jìn)行清除自由基及體外抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：五味子乙素對(duì)自由基的清除效果明顯，其中對(duì)羥自由基清除作用大于相同質(zhì)量濃度的VC，其半數(shù)清除質(zhì)量濃度為0.2mg/mL；對(duì)超氧陰離子自由基清除作用小于VC，其半數(shù)清除質(zhì)量濃度為0.24mg/mL。五味子乙素提取液對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有一定的抑制作用，其中對(duì)白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，最低抑菌濃度為0.25mg/mL，對(duì)根霉、黑曲霉、南洋酵母無(wú)明顯抑菌活性。

五味子；乙素；清除自由基；抑菌

五味子為木蘭科植物五味子(Schisandra chinensis(Turcz.) Baill)的果實(shí)，習(xí)稱“北五味子”?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定其果實(shí)、種子、藤莖均可入藥[1]。其廣泛分布于我國(guó)東北部山區(qū)，它的干燥成熟果實(shí)為臨床常用的滋補(bǔ)性中藥，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功效[2]。木脂素類成分是五味子的主要藥用成分[3-5]，主要具有抗腫瘤、抗病毒、保肝、抗衰老等[6]作用。五味子乙素作為五味子木脂素的主要活性成分之一[7]，伴隨著人們對(duì)木脂素的研究而備受關(guān)注。近年來(lái)研究表明，五味子乙素具有保肝、抗癌、抗?jié)兊人幚碜饔?，已?jīng)被應(yīng)用到醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域中[8-9]。但國(guó)內(nèi)外目前對(duì)于五味子乙素單體的體外抗氧化研究多集中在體內(nèi)組織抗氧化能力[10]，而對(duì)體外抗氧化能力研究的相關(guān)報(bào)道較少；關(guān)于五味子提取物抑菌作用研究，多在五味子總木脂素混合物的抑菌作用研究[11]，其中木脂素單體的抑菌作用和機(jī)理研究較少。

本實(shí)驗(yàn)采用將超臨界萃取五味子粉末，液相色譜制備后的五味子乙素提取液進(jìn)行清除自由基及抑菌作用的研究[12-16]，為開(kāi)發(fā)北五味子深加工產(chǎn)品提供依據(jù)，也為五味子乙素的研發(fā)提供新的可利用資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五味子，2009年10月采于遼寧省新賓縣，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)趙百鎖副教授鑒定為北五味子。

五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%) 上海同田生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀、硫酸亞鐵、鄰菲羅琳、抗壞血酸、鄰苯三酚、濃硫酸、濃鹽酸、雙氧水、無(wú)水乙醇、甲醇、三羥甲基氨基甲烷均為分析純 沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠。

細(xì)菌：枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、白色念珠菌(Candida albicans)、沙門(mén)氏菌(Salmonella)；真菌：南洋酵母(Nanyang yeast)、黑曲霉(Aspergillus niger)、根霉(Rhizopus)。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；電熱恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；電子分析天平 上海天平儀器廠；Hzp-250型全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FT-IR200型傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Thermo公司； 5890高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 五味子乙素提取液清除自由基研究

1.3.1.1 五味子乙素提取液清除羥自由基的測(cè)定

采用超臨界CO2提取五味子粉末，在壓力30MPa，溫度40℃，粒度40目，時(shí)間2h條件下，得到五味子乙素的提取率為3.519mg/g，采用制備液相Symmetry C18色譜柱分離，以甲醇-水為流動(dòng)相，配比70:30洗脫，收集31.2～32.4min五味子乙素提取液。稀釋收集五味子乙素提取液，使五味子乙素的質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL，另配制相同質(zhì)量濃度梯度的抗壞血酸溶液作比較。

五味子乙素提取液結(jié)構(gòu)鑒定：五味子乙素提取液進(jìn)行紅外光譜和HPLC測(cè)定，根據(jù)目標(biāo)成分的峰面積的百分比得出其純度。

參照Fenton反應(yīng)體系及林硯淋等[17]的方法進(jìn)行改進(jìn)，依次加入反應(yīng)液。反應(yīng)體系置于37℃恒溫水浴鍋中，準(zhǔn)確反應(yīng)90min后，立即取出并迅速測(cè)定其在536nm波長(zhǎng)處的吸光度(蒸餾水作參比，便于提高精度，測(cè)3次，取平均值)。清除率的計(jì)算如式(1)所示。

式中：A0為空白組的吸光度；A1為加入0.03%雙氧水的吸光度；A樣品為加入樣品和0.03%雙氧水的吸光度。

1.3.1.2 五味子乙素提取液清除超氧陰離子自由基的測(cè)定

樣品制備：稀釋分離純化后的五味子乙素提取液，使五味子乙素的質(zhì)量濃度分別為：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL，另配制相同質(zhì)量濃度梯度的抗壞血酸溶液作比較。具體步驟參照鄰苯三酚自氧化法[18-19]，在波長(zhǎng)325nm處測(cè)定吸光度。

式中：A00為空白組吸光度；A01為加入鄰苯三酚溶液的吸光度；A10為加入樣品溶液的吸光度； A325為加入樣品和鄰苯三酚溶液的吸光度。

1.3.2 五味子乙素提取液抑菌作用測(cè)定

1.3.2.1 藥液制備

將分離純化后的五味子乙素凍干粉末，用乙醇配制成質(zhì)量濃度為0.25、0.5、1、2、4、8mg/mL溶液，備用。

1.3.2.2 菌種活化

將融化的培養(yǎng)基裝入試管，滅菌后擺斜面。在無(wú)菌條件下用劃線法將供試菌種移接入相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上，于37℃條件下培養(yǎng)18～24h，進(jìn)行菌種斜面活化。

1.3.2.3 供試菌株懸浮液的制備

將活化好的菌種，在無(wú)菌條件下，每種分別挑取兩環(huán)菌苔，各用無(wú)菌水稀釋，配制成一定濃度的菌懸液。

1.3.2.4 含菌平板制作

將新鮮配制的培養(yǎng)基于121℃條件下滅菌，當(dāng)培養(yǎng)基冷至50～60℃時(shí)，于超凈工作臺(tái)上將培養(yǎng)基倒入滅菌的90mm培養(yǎng)皿中，每皿15～20mL培養(yǎng)基，待平板冷卻后，每皿中加入0.5mL菌懸液，用三角玻璃涂棒均勻涂成薄板備用。

1.3.2.5 抑菌作用測(cè)定

參照管碟法，在已放至室溫的培養(yǎng)基上等距均勻放3個(gè)已滅菌的牛津杯，在其中兩個(gè)牛津杯內(nèi)用微量移液器加入等量不同質(zhì)量濃度的五味子乙素提取液，另外一個(gè)作為對(duì)照，加入等量乙醇溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3次，37℃培養(yǎng)24h，觀察并測(cè)量抑菌環(huán)直徑，比較抑菌效果(抑菌圈在15mm以上，抑菌能力強(qiáng)；抑菌圈在10～15mm，抑菌能力較強(qiáng)；抑菌圈在10mm以下，抑菌能力弱)。

2 結(jié)果與分析

2.1 五味子乙素提取液清除自由基

2.1.1 五味子乙素結(jié)構(gòu)鑒定

圖1為將HPLC純化后五味子乙素提取液經(jīng)凍干后的五味子乙素的紅外光譜圖，樣品在2959cm-1處有吸收峰，為—CH2伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明乙素結(jié)構(gòu)中有烷基的存在。樣品在1619cm-1左右處有吸收峰，為芳環(huán)骨架振動(dòng)引起的很強(qiáng)的吸收峰，說(shuō)明了乙素結(jié)構(gòu)中有苯環(huán)的存在。樣品在1418cm-1左右處有吸收峰，為羧基的C＝O的伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明了乙素結(jié)構(gòu)中有羧基的存在。樣品在1329cm-1處有吸收峰，為羧基的C＝O的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明了乙素有羧基的存在。樣品在1046cm-1處有吸收峰，為—OH的變角振動(dòng)峰，說(shuō)明了乙素結(jié)構(gòu)中有羥基的存在。鑒定后的基團(tuán)與圖2中五味子乙素結(jié)構(gòu)符合，基本判定樣品為五味子乙素。圖4為五味子乙素提取液的HPLC圖與圖3五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC對(duì)照，根據(jù)五味子乙素成分的峰面積的百分比得出其純度(純度≥98%)。

圖1 五味子乙素的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectrum of schisandrin B from Schisandra chinensis

圖2 五味子乙素化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of schisandrin B

圖3 五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖Fig.3 HPLC profile of schizandrin B standard

圖4 五味子乙素提取液HPLC圖Fig.4 HPLC profile of schisandrin B from Schisandra chinensis

2.1.2 五味子乙素提取液清除羥自由基

圖5 五味子乙素提取液清除羥自由基能力Fig.5 Comparison of hydroxyl radical scavenging effects of Schisandra chinensis-derived schisandrin B and vitamin C

由圖5可知，在0.1～0.5mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，二者對(duì)羥自由基清除作用較好，并且其清除效果都與其質(zhì)量濃度有一定的關(guān)系，隨質(zhì)量濃度的增加，對(duì)自由基的清除效果增強(qiáng)。另外，總體上五味子乙素提取液對(duì)羥自由基清除作用大于VC，其半數(shù)清除質(zhì)量濃度為0.2mg/mL，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5mg/mL，其清除率接近100%，而抗壞血酸的半數(shù)清除質(zhì)量濃度為0.26mg/mL。

2.1.3 五味子乙素提取液清除超氧陰離子自由基

圖6 五味子乙素提取液清除超氧陰離子自由基能力Fig.6 Comparison of superoxide anion radical scavenging effects of Schisandra chinensis-derived schisandrin B and vitamin C

由圖6可知，在0.1～0.5mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，五味子乙素和VC二者對(duì)超氧陰離子自由基清除作用都較好，清除效果也都與其質(zhì)量濃度有一定的關(guān)系，隨質(zhì)量濃度的增加，對(duì)自由基的清除效果增強(qiáng)?？箟难釋?duì)超氧陰離子自由基清除作用總體上大于五味子乙素提取液，其半數(shù)清除質(zhì)量濃度為0.16mg/mL，而五味子乙素提取液的半數(shù)清除質(zhì)量濃度為0.24mg/mL。

2.2 五味子乙素提取液的抑菌作用

表1 不同質(zhì)量濃度的五味子乙素提取液對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用Table1 Antibacterial effects of Schisandra chinensis-derived schisandrin B at different concentrations

表2 五味子乙素提取液對(duì)供試菌的最低抑菌濃度Table 2 MIC of Schisandra chinensis-derived schisandrin B against tested bacteria

由表1、2可知，五味子乙素提取液在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)供試的幾種細(xì)菌都有抑菌活性，其中對(duì)白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)(圖7)，最低抑菌濃度為0.25mg/mL，對(duì)沙門(mén)氏菌和大腸桿菌的抑制作用最弱，最低抑菌濃度為1mg/mL。同時(shí)根據(jù)抑菌圈的變化，五味子乙素提取液對(duì)供試菌的抑制作用與其質(zhì)量濃度也有一定的關(guān)系，總體上隨著其質(zhì)量濃度的提高，抑菌作用增強(qiáng)。

圖7 五味子乙素提取液對(duì)金黃色葡萄球菌(a)和白色念珠菌(b)抑制作用Fig.7 Bacteriostasis of Schisandra chinensis-derived schisandrin B against Staphylococcus aureus and Candida albicans

表3 不同質(zhì)量濃度的五味子乙素提取液對(duì)真菌生長(zhǎng)的抑制作用Table 3 Anti-fungal effects of Schisandra chinensis-derived schisandrin B at different concentrations

由表3可知，在0.25～8mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，對(duì)供試的3種真菌抑菌活性較弱，特別是兩種霉菌，基本沒(méi)有抑菌圈的出現(xiàn)，雖然南陽(yáng)酵母在五味子乙素質(zhì)量濃度為4mg/mL時(shí)產(chǎn)生抑菌圈，但抑菌圈較小，抑制能力較弱。

3 結(jié) 論

3.1 五味子乙素提取液對(duì)自由基清除效果明顯，其中對(duì)羥自由基清除作用大于相同質(zhì)量濃度的VC，其半數(shù)清除質(zhì)量濃度0.2mg/mL；對(duì)超氧陰離子自由基清除作用小于VC，其半數(shù)清除質(zhì)量濃度為0.24mg/mL。

3.2 五味子乙素提取液對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有一定的抑制作用，其中對(duì)白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，最低抑菌濃度為0.25mg/mL，對(duì)根霉、黑曲霉、南陽(yáng)酵母無(wú)明顯抑菌活性。

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Free Radical-scavenging and Antimicrobial Activities of Schisandrin B from Schisandra chinensis

LI Bin，MENG Xian-jun*，XUE Xue，WU Qian，LI Yuan-su，WANG Yan-qun(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Schisandrin B obtained from the fruits of Schisandra chinensis by supercritical carbon dioxide extraction and subsequent preparative HPLC separation was tested for its free radical-scavenging and antimicrobial activities in vitro. The results showed that Schisandra chinensis-derived schisandrin B had higher hydroxyl radical scavenging effect (IC50 = 0.2 mg/mL)but lower superoxide anion radical scavenging effect (IC50 = 0.24 mg/mL) when compared with vitamin C at the same concentrations. The compound could inhibit Staphylococcus aureus, Candida albicans, Salmonella, E.coli and Bacillus subtilis,especially against Candida albicans and Staphylococcus aureus with a minimum inhibitory concentration (MIC) of 0.25 mg/mL.However, no obvious inhibitory effect on Rhizopus, Aspergillus niger or Nanyang yeast was observed.

Schisandra chinensis (Turcz.) Baill；schisandrin B； free radical-scavenging activity；antimicrobial activity

TS201.2

A

1002-6630(2011)05-0079-04

2010-05-23

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAI09B04)；沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)青年教師基金項(xiàng)目(2010)

李斌(1979—)，男，講師，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物提取及功能性食品開(kāi)發(fā)。E-mail：libinsyau@163.com

*通信作者：孟憲軍(1960—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞罴庸ぜ熬C合利用。E-mail：mengxjsy@126.com