柿子皮提取物的抗氧化活性

賈貴東，楊建雄*，王 芳，徐 樂，包 閩

(陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062)

柿子皮提取物的抗氧化活性

賈貴東，楊建雄*，王 芳，徐 樂，包 閩

(陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062)

為評價柿子皮提取物(persimmon peel extracts，PPE)的抗氧化活性，采用不同的抗氧化評價方法以及Fe2+-H2O2或Fe2+-VC誘導(dǎo)的離體鼠肝線粒體損傷模型。結(jié)果顯示：PPE具有良好的總抗氧化活性、還原力、脂質(zhì)過氧化抑制力以及自由基清除能力；清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基(O2·)、羥自由基(·OH)的IC50值分別為57、137、425μg/mL；另外，PPE能顯著地抑制線粒體脂質(zhì)過氧化、腫脹、蛋白氧化和ATPase活性降低。說明PPE有明顯的體外抗氧化活性，有可能作為一種天然抗氧化劑的新原料。

柿子皮；抗氧化；自由基；線粒體

柿為柿科(Ebenaceae)柿屬(Diospyros kaki)植物，生長于熱帶、亞熱帶及暖溫帶地區(qū)，在日本、韓國、中國、巴西、意大利等國廣泛栽培[1]。柿含有很多生物活性成分，如多酚、黃酮、萜類化合物、類固醇、飲食纖維、類胡蘿卜素和礦物質(zhì)[2]。在中國，柿果和柿葉被用于治療咳嗽、過度緊張、呼吸困難、麻痹、凍瘡、燒傷及出血，也有抗氧化和清除自由基效應(yīng)的報道[3]。

柿子皮是加工柿子餅的下腳料，不但含有大量的維生素和胡蘿卜素，還富含粗蛋白質(zhì)和膳食纖維、果膠。柿子皮只是部分作為食品填料，大部分白白浪費，近年來已有柿子皮多酚的除臭效果[4]及其對細(xì)胞的保護作用[5]、柿子皮果膠對金的選擇吸附[6]、柿子皮提取物的藥理活性[7]、以及柿子皮綜合利用和深加工[8]的相關(guān)報道。但是，關(guān)于柿子皮活性成分的抗氧化活性還沒有系統(tǒng)的研究。因此，本實驗用70%乙醇提取，經(jīng)DA-201型大孔吸附樹脂初步純化，制備了柿子皮提取物(persimmon peel extracts，PPE)，測定PPE主要活性成分含量，采用體外化學(xué)模擬體系測定PPE的抗氧化活性和對鼠肝線粒體的保護作用，以期進(jìn)一步揭示柿子皮的藥理作用機制，促進(jìn)柿子皮作為天然抗氧化劑原料的開發(fā)和利用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

柿子(Diospyros kaki)采集于陜西師范大學(xué)校園，柿子皮低溫干燥后粉碎，過篩備用。

1,1-二苯基-2-苦苯肼(DPPH)、2,6二叔丁基對甲酚(BHT)、抗壞血酸(VC)、焦性沒食子酸(PA)、蘆丁(rutin)、葡萄糖、β-胡蘿卜素、亞油酸 美國Sigma公司；NBT、PMS、NADH、脫氧核糖 德國Applichem公司；DA-201型大孔吸附樹脂、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、甲醇、Tween-20、鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)、三氯化鐵(FeCl3)、雙氧水、硫酸亞鐵、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純。

TU-1810型可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機 寧波新芝生物科技股份有限公司；SIGMAD-37520型高速冷凍離心機 美國Sigma公司。

1.2 實驗動物

雄性SD大鼠(約200g)由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 PPE的制備

取柿皮粉末200g，用70%乙醇溶液作為提取試劑，料液比1:10(m/V)，分裝在5個圓底燒瓶中，混勻，裝上回流冷凝管，水浴加熱保持溶液近沸狀態(tài)，80℃回流提取2h后，將濾液轉(zhuǎn)入燒杯，殘渣用以上方法重復(fù)提取1次，合并兩次濾液，并于50℃減壓濃縮后，得粗提物36.2g，取7.2g粗提物制成40mL水溶液，上載于含DA-201型大孔吸附樹脂的玻璃色譜柱(5cm×80cm)上，以2.5mL/min的流速用3倍床體積的水洗脫除雜后，用3倍床體積的50%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液并于50℃減壓濃縮，濃縮液置培養(yǎng)皿中，在鼓風(fēng)干燥箱中50℃烘干即為所得提取物PPE，并計算得率(以每100g柿子皮粉末中含PPE的克數(shù)表示)。

1.3.2 PPE中活性成分含量測定

以葡萄糖、蘆丁、焦性沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品分別測定PPE中總糖、總黃酮及多酚含量，方法分別采用苯酚硫酸法[9]、亞硝酸鈉-硝酸鋁法[10]、Folin-酚法[11]。結(jié)果分別根據(jù)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程計算出所測PPE中總糖、總黃酮及多酚的相應(yīng)質(zhì)量濃度(mg/mL)，進(jìn)一步可以換算出PPE中總糖、總黃酮及多酚的含量。

式中：ω為總糖、總黃酮及多酚的相應(yīng)含量；ρ1表示所加樣品中PPE的質(zhì)量濃度；ρ2表示根據(jù)線性回歸方程計算出的PPE中總糖、總黃酮及多酚的相應(yīng)質(zhì)量濃度。

1.3.3 PPE抗氧化活性測定

對DPPH自由基、O2·清除能力、總抗氧化能力、還原力測定參照張改平等[12]方法；對·OH的清除能力測定參照Sakanaka等[13]的方法；抗脂質(zhì)過氧化能力測定參照張爾先等[14]方法。以BHT、VC、蘆丁、PA為陽性對照。

式中：A樣為加入BHT、VC、蘆丁、PA、PPE的樣品溶液的吸光度；A陰性對照為未加入BHT、VC、蘆丁、PA、PPE的樣品溶液的吸光度。

1.3.4 PPE對鼠肝線粒體的保護作用

1.3.4.1 鼠肝線粒體制備及蛋白含量測定

鼠肝線粒體制備參照Kamat等[15]的方法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，通過Lowry法測定線粒體懸浮液中蛋白質(zhì)的含量。

1.3.4.2 線粒體損傷模型的建立

采取Fe2+-H2O2體系和Fe2+-VC體系產(chǎn)生·OH誘導(dǎo)離體鼠肝線粒體損傷。

1.3.4.3 對Fe2+-H2O2誘導(dǎo)鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化的測定

參照TBA法間接測定脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的丙二醛(MDA)量以反映過氧化程度，參照楊建雄等[16]的方法測定。

式中：A樣為加入PPE的樣品溶液的吸光度；A陰性對照為未加入PPE的樣品溶液的吸光度。

1.3.4.4 對Fe2+-VC誘導(dǎo)鼠肝線粒體腫脹度的測定

根據(jù)線粒體腫脹導(dǎo)致其渾濁度降低，參照盛偉等[17]的方法，測定A520nm評價線粒體的腫脹程度。

1.3.4.5 對Fe2+-VC誘導(dǎo)鼠肝線粒體中蛋白質(zhì)羰基含量的測定

采用2,4-二硝基苯肼(DNPH)比色法，具體操作步驟參照Aakatay等[18]的方法。羰基濃度用摩爾消光系數(shù)ε = 22000L/(mol·cm)來計算，羰基含量用每mg蛋白中所含羰基的nmol表示。

1.3.4.6 對Fe2+-VC誘導(dǎo)鼠肝線粒體中ATP酶活性的測定

按Okatani等[19]的方法，以KH2PO4為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(鉬藍(lán)法測定磷含量)。ATP酶的活性可以用每毫克蛋白質(zhì)每小時新生成的無機磷的量(μmol/(mg·h))表示。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 PPE得率及活性成分含量

結(jié)果分析，PPE得率為2.17%，總糖、總黃酮及多酚含量分別根據(jù)線性回歸方程：y=7.3293x+0.0106(R2=0.9944，y為吸光度，x為質(zhì)量濃度)、y=0.9779x+0.0305(R2=0.9942)、y=32.423x + 0.002(R2=0.9996)計算，其含量分別為15.63%、25.85%、47.05%。

2.2 PPE對DPPH自由基的清除率

圖1 PPE、BHT和VC對DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging activity of PPE , BHT and VC on DPPH free radicals

抗氧化劑能夠清除DPPH自由基歸因于其提供質(zhì)子的能力。圖1表明，PPE能很好的清除DPPH自由基，且清除率隨著質(zhì)量濃度的升高而增大，雖然在相同質(zhì)量濃度時對DPPH自由基的清除率PPE＜BHT＜VC，但在150μg/mL時三者對DPPH自由基清除率接近，達(dá)到93%左右。PPE的IC50(57μg/mL)雖高于VC(15μg/mL)和BHT(20μg/mL)，但其來自天然材料，安全性比人工合成的BHT好，穩(wěn)定性比VC高。說明PPE是良好的質(zhì)子供體，對DPPH自由基的清除能力可能與其所含的黃酮和其他多酚有關(guān)。

2.3 PPE對O2·的清除率

圖2 PPE、PA和蘆丁對O2·的清除率Fig.2 Scavenging activity of PPE, PA and rutin on superoxide anion free radicals

如圖2所示，在所測劑量范圍內(nèi)，PPE、PA和蘆丁對O2·具有較強的清除率，且呈較好的量效關(guān)系，其IC50分別為137、139、88μg/mL。PPE對O2·的清除率低于蘆丁，但高于PA，在400μg/mL時最高達(dá)(88.05±4.79)%，說明PPE是一種很好的O2·清除劑，其較高的清除能力可能是由于PPE中混合成分在清除O2·時存在協(xié)同作用。

2.4 PPE對·OH的清除率

圖3 PPE和VC對·OH的清除率Fig.3 Scavenging activity of PPE and VC on hydroxyl radicals

如圖3所示，在所測質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，PPE具有較好的·OH清除率，且表現(xiàn)出劑量依賴性，IC50為425μg/mL(VC為62μg/mL)。PEE能夠清除化學(xué)性質(zhì)最活潑，反應(yīng)性極強的羥自由基，說明PPE具有良好的抗氧化作用，PPE中的多酚可能是清除·OH的主要成分。

2.5 PPE對脂質(zhì)過氧化的抑制作用

圖4 PPE、VC和蘆丁對脂質(zhì)過氧化的抑制率Fig.4 Inhibition activity of PPE, VC and rutin on lipid peroxidation

脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物是造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞損傷的重要原因之一。由圖4可看出，PPE、VC和蘆丁對脂質(zhì)過氧化有明顯的抑制作用，且在測試質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的量效關(guān)系，IC50分別為46、155μg/mL和37μg/mL。PPE良好的抑制脂質(zhì)過氧化作用可能是由于其中含有的酚羥基具有提供電子的能力，使脂質(zhì)氧化過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基失活，從而中斷其引起進(jìn)一步氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

2.6 PPE的總抗氧化活性

β-胡蘿卜素是一種多烯色素，易被反應(yīng)體系中的亞油酸自氧化產(chǎn)生的過氧化物氧化而褪色，當(dāng)反應(yīng)體系中有抗氧化劑時，褪色速度減緩。由圖5可見，當(dāng)體系中加入不同質(zhì)量濃度的VC、PPE和BHT后，β-胡蘿卜素的褪色程度較陰性對照大大減緩，樣品質(zhì)量濃度越大褪色速度越慢?？梢钥闯?，PPE有較強的總抗氧化活性。

圖5 PPE、VC和BHT的總抗氧化活性Fig.5 Total antioxidant activity of PPE, VC and BHT

2.7 PPE的還原力

圖6 PPE、VC和BHT的還原力Fig.6 Reducing power of PPE, VC and BHT

一種物質(zhì)的還原力大小可以反映其潛在抗氧化性能。如圖6所示，隨著質(zhì)量濃度的增大，其還原力逐漸增強，在同質(zhì)量濃度時PPE、VC和BHT的還原力大小順序為：VC＞BHT＞PPE，PPE在500μg/mL時，吸光度為0.703±0.049，與VC在100μg/mL時的吸光度相當(dāng)。PPE良好的還原能力說明其含有的多酚和黃酮類物質(zhì)可以作為良好的電子供體，具有潛在的抗氧化能力。

2.8 PPE對鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化的影響

圖7 PPE對線粒體脂質(zhì)過氧化的影響Fig.7 Effect of PPE on lipid peroxidation in mouse liver mitochondria

通過間接測定MDA的生成量來反映受試物抑制線粒體脂質(zhì)過氧化能力。如圖7所示，當(dāng)反應(yīng)體系中有PPE時，明顯抑制脂質(zhì)過氧化，且隨著質(zhì)量濃度的增加而增強，在劑量范圍內(nèi)可高達(dá)(92.02±3.94)%。提示PPE對鼠肝線粒體脂質(zhì)氧化有明顯的抑制作用，這可能是由于PPE能清除脂質(zhì)氧化誘導(dǎo)產(chǎn)生的·OH及由·OH誘導(dǎo)產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基或阻斷脂質(zhì)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

2.9 PPE對鼠肝線粒體腫脹度的影響

圖8 PPE對線粒體腫脹度的影響Fig.8 Effect of PPE on mouse liver mitochondrial swelling

線粒體腫脹是由于線粒體受損，膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變所致。由圖8可見，隨著測試時間的延長，各組A520nm值下降，其中正常組變化不大(100min后吸光度僅降低了0.037)，損傷組下降幅度最大(20min時已經(jīng)降低了0.147)，樣品組下降趨勢減緩，且隨著樣品質(zhì)量濃度的增大減緩趨勢更為明顯，說明PPE可以抑制·OH所導(dǎo)致的氧化損傷，使線粒體腫脹減輕。

2.10 PPE對鼠肝線粒體蛋白羰基含量的影響

圖9 PPE對線粒體蛋白羰基含量的影響Fig.9 Effect of PPE on protein carbonyl content of mouse liver mitochondria

蛋白質(zhì)中的氨基酸容易受到自由基的攻擊，導(dǎo)致蛋白羰基的積累。從圖9可知，與正常組相比，損傷組蛋白羰基水平顯著升高(P＜0.001)，高達(dá)(37.63±1.16)nmol/mg，而正常組的羰基含量僅為(4.73±1.67)nmol/mg；樣品組蛋白羰基含量雖高于正常組，但隨著PPE質(zhì)量濃度的增加羰基含量較損傷組逐漸減小，且差異顯著(P＜0.01，P＜0.001)，表明PPE可以有效地抑制蛋白質(zhì)氧化損傷，在400μg/mL時，羰基含量為(9.45±2.96)nmol/mg，抑制率高達(dá)86.64%，說明PPE具有較強的抗氧化作用。

2.11 PPE對鼠肝線粒體ATP酶活性的影響

圖10 PPE對線粒體ATP酶活性的影響Fig.10 Effect of PPE on ATPase activity of mouse liver mitochondria

ATP酶能夠水解ATP生成ADP和無機磷，通過測定無機磷的釋放量即可反映線粒體ATP酶的活性。圖10表明，損傷組線粒體ATP酶活性較正常組顯著下降(P＜0.001)，當(dāng)反應(yīng)體系存在PPE時，ATP酶得到保護，且差異顯著(P＜0.01，P＜0.001)，當(dāng)PPE質(zhì)量濃度為600μg/mL時，ATP酶的活性接近正常水平，這充分說明PPE在線粒體受損時對ATP酶活性影響較大，能夠抑制ATP酶氧化損傷。

3 結(jié) 論

PPE具有很強的清除DPPH自由基、O2·能力和抑制脂質(zhì)過氧化能力，有較強的清除·OH能力和總抗氧化活性，具有一定的還原力。另外，PPE能顯著地抑制鼠肝線粒體蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化損傷、保護ATP酶的活性和抑制線粒體發(fā)生腫脹，所有測定指標(biāo)都有較好的劑量依賴性，表明PPE具有較好的抗氧化活性，說明柿子皮有可能作為新型天然抗氧劑的原料。

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Antioxidant Activity of Persimmon Peel Extracts

JIA Gui-dong，YANG Jian-xiong*，WANG Fang，XU Le，BAO Min
(College of Life Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China)

In order to evaluate the antioxidant activity of persimmon peel extracts (PPE) in vitro, different antioxidant evaluation assays and a mouse model of liver mitochondrial damage induced by Fe2+-H2O2 or Fe2+-VC in vitro were used. The results showed that PPE possessed excellent total antioxidant activity, reducing power, inhibitory activity against lipid peroxidation and radical scavenging activity. The IC50 values against DPPH, superoxide anion and hydroxyl radicals were 57, 137μg/mL and 425 μg/mL,respectively. In addition, PPE could significantly protect mitochondria from lipid peroxidation, swelling, protein oxidation and the reduction of ATPase activity in rats. In conclusion, the current study showed that PPE can resist oxidation obviously in vitro and be utilized as a new natural source of antioxidant.

persimmon peel；antioxidant；free radical；mitochondria

R151.2

A

1002-6630(2011)05-0045-05

2010-06-19

國家自然科學(xué)基金項目(20175012)；陜西師范大學(xué)大學(xué)生開放性實驗基金項目

賈貴東(1982—)，男，碩士，主要從事天然產(chǎn)物的分離及功能評價研究。E-mail：jgdong1012@qq.com

*通信作者：楊建雄(1954—)，男，教授，碩士，主要從事天然產(chǎn)物的分離及功能評價研究。

E-mail：jxyang@snnu.edu.cn