鐵椆與紅菇提取液抑菌作用的比較

劉英姿，甘耀坤，陳旭健，明庭會(huì)，曾獻(xiàn)瑩

(1.玉林師范學(xué)院化學(xué)與生物系，廣西 玉林 537000；2.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004)

鐵椆與紅菇提取液抑菌作用的比較

劉英姿1,2，甘耀坤1,2，陳旭健1，明庭會(huì)1，曾獻(xiàn)瑩1

(1.玉林師范學(xué)院化學(xué)與生物系，廣西 玉林 537000；2.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004)

研究鐵椆樹根、鐵椆果仁與紅菇子實(shí)體的抑菌效果。以80%乙醇為提取劑，運(yùn)用超聲波技術(shù)分別制備鐵椆樹根、鐵椆果仁、紅菇子實(shí)體提取液，測(cè)定它們?cè)谝欢ㄙ|(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)、藤黃微球菌(Micrococcus lueus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、產(chǎn)氣氣桿菌(Aerobacter aerogenns)、卡爾伯斯酵母(Karlperth yeast)、阿達(dá)青霉(Penicillium adametzi Zaleski)6種供試菌種的抑菌作用，并對(duì)其大小進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在測(cè)試質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，3種測(cè)試提取液對(duì)大腸桿菌、藤黃微球菌、卡爾伯斯酵母均有抑制作用，其中對(duì)大腸桿菌、藤黃微球菌抑制作用比較明顯，且隨質(zhì)量濃度升高抑菌作用增強(qiáng)；抑菌效果為鐵椆樹根>鐵椆果仁>紅菇子實(shí)體。研究表明，鐵椆樹根、鐵椆果仁和紅菇子實(shí)體3種提取液對(duì)不同菌種的抑菌作用有一定的選擇性，抑菌效果順序?yàn)殍F椆樹根最好、鐵椆果仁次之，且抑菌效果在2.0g/mL質(zhì)量濃度條件下較好。

鐵椆；紅菇；超聲波提??；抑菌作用

紅菇(Russula)又名美麗紅菇，鱗蓋紅菇，營(yíng)養(yǎng)豐富，鮮美可口，具有補(bǔ)血、滋陰、清涼解毒之功效，是一種野生名貴珍稀食用菌[1]。鐵椆(Cyclobalanopsis glauca)又名青岡櫟、青栲、鐵櫟，是紅菇的主要共生樹種，其種子含淀粉；樹皮、殼斗含鞣質(zhì)；種仁可用于止渴，止痢疾，破惡血，健行；樹皮有止產(chǎn)婦流血的功效；嫩葉可以治療臁瘡等[2-3]。近年來(lái)，不少學(xué)者研究了紅菇的抗菌、抗氧化、抗運(yùn)動(dòng)性疲勞作用和紅菇對(duì)血糖血脂的影響[4-7]，也對(duì)紅菇的共生樹種——鐵椆的抗氧化、抗運(yùn)動(dòng)性疲勞作用進(jìn)行了探討[8-9]，了解到紅菇和鐵椆具有多種抗性機(jī)能且有相依性，但鐵椆是否具有抑菌機(jī)能？它和紅菇的抑菌作用有何異同？目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬采用超聲波技術(shù)分別制備鐵椆樹根、鐵椆果仁與紅菇子實(shí)體提取液，測(cè)定它們?cè)谝欢ǖ馁|(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)、藤黃微球菌(Micrococcus lueus)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、產(chǎn)氣氣桿菌(Aerobacter aerogenns)、卡爾伯斯酵母(Karlperth yeast)、阿達(dá)青霉(Penicillium adametzi Zaleski)6種供試菌種的抑菌作用，并對(duì)其大小進(jìn)行比較，探討鐵椆與紅菇在抑菌方面的利用價(jià)值，為天然抑菌藥物的開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

紅菇子實(shí)體和鐵椆樹根、果仁由廣西容縣自良鄉(xiāng)紅菇基地提供。

1.2 供試菌種及培養(yǎng)基

1)細(xì)菌：大腸桿菌(Escherichia coli)、藤黃微球菌(Micrococcus lueus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、產(chǎn)氣氣桿菌(Aerobacter aerogenns)；2)酵母菌：卡爾伯斯酵母(Karlperth yeast)；3)霉菌：阿達(dá)青霉(Penicillium adametzi Zaleski)，由玉林師范學(xué)院化學(xué)與生物系微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

參照凌建亞等[10]的方法配制不同菌種培養(yǎng)基：1)葡萄糖-酵母汁-蛋白胨培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)酵母菌；2)牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)細(xì)菌；3)沙氏瓊脂培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)霉菌。

1.3 抑菌提取液的制備

將紅菇子實(shí)體和鐵椆樹根、果仁洗凈、烘干；然后分別使用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎得粉末；分別稱取一定量的粉末，加入80%乙醇溶劑，冰水浴超聲波提取[4]，離心(4000r/min，10min)后的上清液經(jīng)蒸發(fā)濃縮成一定濃度的粗提液；再根據(jù)需要分別將粗提液于80℃條件下蒸發(fā)濃縮成質(zhì)量濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、6.0g/mL的紅菇、鐵椆樹根、果仁提取液，滅菌后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 方法

1.4.1 不同濃度的紅菇子實(shí)體和鐵椆樹根、果仁提取液對(duì)不同菌種抑制作用的測(cè)定

參照陸志科等[11]的方法并稍作改動(dòng)。以80%乙醇和無(wú)菌的蒸餾水作對(duì)照(CK)，分別記為CK1和CK2。以紅菇子實(shí)體提取液為例，選擇質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0g/mL 4種梯度提取液，將滅菌并干燥的濾紙片(直徑1.0cm)分別浸入這4種梯度質(zhì)量濃度提取液中，浸透(一般需浸泡5h以上)。用無(wú)菌鑷子將浸好的濾紙片夾起并分別貼在已制備好的接種培養(yǎng)基平板上，同時(shí)貼空白對(duì)照濾紙片，貼好濾紙片的平板置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。再分別用鐵椆樹根和果仁的提取液重復(fù)以上步驟。細(xì)菌于35～37℃培養(yǎng)18～24h，霉菌、酵母菌置于28℃條件下培養(yǎng)44～48h。

1.4.2 1.0g/mL的紅菇子實(shí)體和鐵椆樹根、果仁提取液對(duì)大腸桿菌抑制作用的比較

將滅菌并干燥的濾紙片(直徑1.0cm)分別浸入1.0g/mL的紅菇子實(shí)體和鐵椆樹根、果仁提取液中，浸透(一般需浸泡5h以上)。用無(wú)菌鑷子將浸好的濾紙片夾起并貼在已制備好的接種培養(yǎng)基平板上，同時(shí)貼上80%乙醇和無(wú)菌的蒸餾水空白對(duì)照濾紙片。貼好濾紙片的平板置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于35～37℃培養(yǎng)18～24h。

1.4.3 瓊脂稀釋法測(cè)定提取液最小抑菌濃度(MIC)

根據(jù)消毒技術(shù)規(guī)范(2002年版)[12]，在無(wú)菌超凈工作臺(tái)上，用滅菌的移液器吸取不同質(zhì)量濃度的3種測(cè)試提取液0.3mL分別加入到無(wú)菌培養(yǎng)皿中，倒入約20mL冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基，混合均勻。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，用滅菌的移液器吸取0.01mL(含菌數(shù)約105個(gè)/mL)的菌懸液分別加入到上述平板培養(yǎng)基中，用涂布棒涂布均勻。每個(gè)平板做3個(gè)重復(fù)。將細(xì)菌于37℃恒溫培養(yǎng)24h、霉菌和酵母菌于28℃恒溫培養(yǎng)48h后進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的紅菇子實(shí)體、鐵椆樹根、果仁提取液對(duì)不同菌種的抑制作用

表1 不同質(zhì)量濃度提取液對(duì)不同菌種的抑菌圈直徑Table 1 Antibacterial ring diameters of extracts from Russula and Cyclobalanopsis glauca with various concentrations cm

從表1可以看出，紅菇子實(shí)體、鐵椆樹根、果仁3種測(cè)試提取液在質(zhì)量濃度0.5、1.0、1.5、2.0g/mL條件下，對(duì)大腸桿菌和藤黃微球菌的抑制作用較明顯，對(duì)卡爾伯斯酵母的抑制作用次之，且3種測(cè)試提取液的抑菌圈隨著其質(zhì)量濃度的升高而變大，而對(duì)金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣氣桿菌和阿達(dá)青霉沒(méi)有抑制作用。

2.2 1.0g/mL的紅菇子實(shí)體和鐵椆樹根、果仁提取液對(duì)大腸桿菌的抑制作用

圖1 1.0g/mL的紅菇子實(shí)體和鐵椆樹根、果仁提取液對(duì)大腸桿菌的抑制作用Fig.1 Bacteriostatic effects of extracts from Russula and Cyclobalanopsis glauca roots and nut at a concentration of 1.0 g/mL on E. coli in comparison with sterile distilled water and 80% ethanol

由圖1可知，當(dāng)提取液的質(zhì)量濃度為1.0g/mL時(shí)，3種測(cè)試提取液對(duì)大腸桿菌均有抑菌效果，從其抑菌圈直徑的大小來(lái)看，鐵椆樹根提取液＞鐵椆果仁提取液＞紅菇子實(shí)體提取液。

2.3 瓊脂稀釋法測(cè)定提取液最小抑菌濃度(MIC)結(jié)果

表2 不同材料、不同質(zhì)量濃度的提取液最小抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果Table 2 Minimum inhibitory concentrations of extracts from Russula and Cyclobalanopsis glauca roots and nut at various concentrations

從表2可以看出，紅菇子實(shí)體對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.5g/mL，對(duì)藤黃微球菌的最小抑菌濃度為1.0g/mL，對(duì)卡爾伯斯酵母的最小抑菌濃度為3.0g/mL；鐵椆樹根對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.5g/mL，對(duì)藤黃微球菌的最小抑菌濃度為1.0g/mL，對(duì)卡爾伯斯酵母的最小抑菌濃度為2.0g/mL；鐵椆樹果仁對(duì)大腸桿菌和藤黃微球菌的最小抑菌濃度都為0.5g/mL，對(duì)卡爾伯斯酵母的最小抑菌濃度為1.5g/mL。總體上看，對(duì)不同菌種而言，最小抑菌濃度為大腸桿菌、藤黃微球菌的較小，卡爾伯斯酵母的較大；對(duì)不同的提取液而言，最小抑菌濃度為：鐵椆果仁＜鐵椆樹根＜紅菇子實(shí)體。

3 結(jié) 論

在濾紙圓片測(cè)試培養(yǎng)中，抑菌效果為鐵椆樹根提取液>鐵椆果仁提取液＞紅菇子實(shí)體提取液；在瓊脂稀釋法測(cè)定提取液最小抑菌濃度的結(jié)果中，最小抑菌濃度為鐵椆果仁提取液＜鐵椆樹根提取液＜紅菇子實(shí)體提取液?？偟膩?lái)說(shuō)，3種測(cè)試提取液中，鐵椆樹根和果仁提取液的抑菌效果相當(dāng)，而紅菇子實(shí)體提取液的抑菌效果較差。至于抑菌成分和作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)紅菇及其共生樹種鐵椆樹根和果仁對(duì)供試菌種的抑制作用比較，在一定程度上證明了鐵椆具有與紅菇子實(shí)體一樣的抑菌作用或抗菌活性，且效果相對(duì)較好，對(duì)紅菇子實(shí)體及其共生樹種的綜合開(kāi)發(fā)，研制天然抑菌藥物、天然防腐抑菌劑具有重要的指導(dǎo)意義。

[1] 甘耀坤, 趙良發(fā), 戴盧, 等. 野生紅菇研究綜述[J]. 玉林師范學(xué)院學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2005, 26(3): 70-74.

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[12] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. 消毒技術(shù)規(guī)范(2002年版)[M]．北京: 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部, 2002．

Comparison of Bacteriostatic Effects between Extracts from Russula and Cyclobalanopsis glauca

LIU Ying-zi1,2，GAN Yao-kun1,2，CHEN Xu-jian1，MING Ting-hui1，ZENG Xian-ying1
(1. Department of Chemistry and Biology, Yulin Normal University, Yulin 537000, China；2. College of Life Science, Guangxi Normal University, Guilin 541004, China)

The bacteriostatic effects of extracts from Russula and Cyclobalanopsis glauca were studied in this paper. Russula roots and Cyclobalanopsis glauca roots and nut were subjected to solvent extraction with 80% ethanol under ultrasonic assistance,and the extracts from both plants were comparatively evaluated for their bacteriostatic effects on Escherichia coli, Micrococcus lueus, Staphylococcus aureus, Aerobacter aerogenns, Karlperth yeast, Penicillium adametzi Zaleski. Results indicated that three extracts had inhibitory effects on Escherichia coli, Micrococcus luteus, and Karlperth yeast. Meanwhile, the inhibitory effects of these extracts on Escherichia coli and Micrococcus luteus were more obvious and exhibited a concentration-dependent manner.Minimum inhibitory concentrations against Karlperth yeast increased in the following order: Cyclobalanopsis glauca root extract ＜Cyclobalanopsis glauca nut extract ＜ Russula extract. Moreover, the optimal inhibitory concentrations of these extracts were all 2.0 g/mL.

Cyclobalanopsis glauca；Russula；ultrasonic extraction； bacteriostatic effect

Q939.97

A

1002-6630(2011)05-0036-03

2010-06-16

廣西科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(桂科自0728250)；廣西教育廳科研項(xiàng)目(200709LX140)；

廣西教育廳科研項(xiàng)目(200810LX403)

劉英姿(1975—)，女，碩士，主要從事分子生態(tài)學(xué)研究。E-mail：lyz3377@126.com