博士1:4對蚯蚓的毒性效應(yīng)研究

李 冰，白桂芬，張 帥

（赤峰學(xué)院 生命科學(xué)系，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

博士1:4對蚯蚓的毒性效應(yīng)研究

李 冰，白桂芬，張 帥

（赤峰學(xué)院 生命科學(xué)系，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

采用濾紙接觸法和自然土壤法對內(nèi)蒙古赤峰市周邊地區(qū)蚯蚓進(jìn)行染毒，研究了赤峰市周邊地區(qū)普遍使用的博士1：4對蚯蚓的毒性效應(yīng).單一試驗(yàn)的結(jié)果表明：兩種方法均能引起蚯蚓中毒或死亡，濾紙法48h時(shí)博士1：4半致死濃度(LC50)為2.8732g/L.自然土壤法14d時(shí)蚯蚓有明顯中毒現(xiàn)象，但無死亡情況.

蚯蚓；博士1：4；單一污染；濾紙接觸法；自然土壤法

土壤是人類賴以生存的基礎(chǔ)，土壤質(zhì)量狀況與人類的健康和發(fā)展息息相關(guān).隨著工業(yè)和石油農(nóng)業(yè)迅猛發(fā)展，工業(yè)廢棄物、化肥和農(nóng)藥等污染物質(zhì)的大量排放和施用，給土壤環(huán)境造成相當(dāng)嚴(yán)重的影響，也給人類健康帶來潛在風(fēng)險(xiǎn).因此，對土壤質(zhì)量的評價(jià)和污染物質(zhì)毒性的測定是必要的.蚯蚓生態(tài)毒理試驗(yàn)正是在這樣的需要下發(fā)展起來的[1].蚯蚓作為土壤無脊椎動(dòng)物的代表，在保持和改善土壤結(jié)構(gòu)、提高土壤肥力、改善土壤透氣性、吸收并降解土壤中的有機(jī)物等方面有著重要作用[2].蚯蚓是常見的雜食性環(huán)節(jié)動(dòng)物，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中具有極其重要的地位，常被作為土壤污染的指示動(dòng)物，廣泛用于土壤生態(tài)毒性研究[4].因此蚯蚓在農(nóng)田中具有不可或缺的重要作用.隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，人類為了滿足日益增長的各種需求，追求農(nóng)田利益的最大化，在農(nóng)業(yè)中普遍使用化肥、農(nóng)藥的現(xiàn)象明顯增加.但化肥、農(nóng)藥顯著增加了農(nóng)業(yè)利益的同時(shí)，也給土壤環(huán)境帶來了巨大的負(fù)面影響，致使農(nóng)藥污染的現(xiàn)象也日趨嚴(yán)重.本試驗(yàn)以蚯蚓為實(shí)驗(yàn)材料以內(nèi)蒙古赤峰地區(qū)普遍使用的農(nóng)藥博士1:4為代表，對生物農(nóng)藥的安全可靠性進(jìn)行檢測，為赤峰市周邊地區(qū)農(nóng)藥污染的生態(tài)學(xué)檢測、農(nóng)業(yè)害蟲的生物學(xué)防治提供理論依據(jù)，同時(shí)也為科學(xué)地評價(jià)這種農(nóng)藥的生態(tài)安全性積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試動(dòng)物：蚯蚓在赤峰市周邊地區(qū)蔬菜大棚中采集，試驗(yàn)選擇體重為400～500mg，環(huán)帶明顯，大小基本一致的健康成蚓.供試土壤：采用蚯蚓原生地土壤，主要采集表層土（0～20cm），采回后經(jīng)篩細(xì)待用.供試污染物：博士1:4，主要成分為二嗪磷，是廣譜性有機(jī)磷殺蟲劑，具有觸殺、胃毒和一定的內(nèi)吸作用.其作用機(jī)理為抑制酰膽堿酯酶，二嗪磷，英文通用名稱：Diazinon，分子式：C12H21N2O3PS，化學(xué)名稱:O，O-二乙基-O-（2-異丙基-6-甲基-4-嘧啶基）硫逐磷酸酯，結(jié)構(gòu)式：

本實(shí)驗(yàn)采用的農(nóng)藥博士1:4是由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)與中國農(nóng)業(yè)大學(xué)聯(lián)合研制，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化工實(shí)驗(yàn)廠生產(chǎn)，生產(chǎn)日期為2009年10月1日，生產(chǎn)批件：HNP41025-A6814，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：Q/HNSH03-2006，登記證號(hào)：SY20067618，保質(zhì)期為兩年.試驗(yàn)器材：玻璃培養(yǎng)皿（直徑15cm，高2.5cm），濾紙（直徑 15cm，中速），塑料小桶（上直徑15cm,下直徑10cm高8cm，容量1000mL），燒杯等.污染物試驗(yàn)濃度設(shè)計(jì)：正式試驗(yàn)前進(jìn)行濃度范圍選擇試驗(yàn),確定污染物對蚯蚓染毒歷時(shí)48h時(shí)（濾紙法）和14d（自然土壤法）的最小致死濃度和最大致死濃度，在此區(qū)間內(nèi)設(shè)置各污染物水溶液的正式單一毒性試驗(yàn)濃度序列.最后確定濾紙法的試驗(yàn)濃度為：1.5;2.0;2.5;3.0;3.5;4.0g/L；自然土壤法的試驗(yàn)濃度：30;40;50;60;70;80g/L.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 濾紙接觸法

將挑選的蚯蚓洗凈表面泥土后放入1L的已濕潤的燒杯中，置于暗處清腸一晝夜（以除去腸道內(nèi)的雜物等）[7].在玻璃培養(yǎng)皿中鋪濾紙（中速）3張，以剛好遮住皿底為宜.將10mL博士1:4水溶液按試驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度注入墊有3張濾紙的培養(yǎng)皿中，使濾紙全部浸濕.每一濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并設(shè)置1個(gè)不含藥物的空白對照，再將清腸后的蚯蚓沖洗干凈，用濾紙吸去多余水分[8].每處理放入10條蚯蚓，用保鮮薄膜封口，并用解剖針扎孔保持透氣.定期觀察并記錄毒理癥狀和行為；并于24h、48h各觀察1次死亡數(shù)，以前尾部對機(jī)械刺激無反應(yīng)視為死亡[8].將試驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)，應(yīng)用簡明統(tǒng)計(jì)10.35（Concise Statistics,CS10.35)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理.

1.2.2 自然土壤法

將蚯蚓洗凈后放入1L燒杯中，噴灑少量水，清腸24h.將500ml蚯蚓原生地土壤倒入解剖盤中，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度分別量取10mL博士1:4水溶液放入土壤中混勻后倒入塑料小桶.再將清腸后的蚯蚓沖洗干凈，用濾紙吸去多余水分[8].每處理放入10條蚯蚓，如此每濃度分別設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù).放置陰暗處，并于每天7時(shí)、18時(shí)各噴水一次以保持土壤濕度.觀察并記錄蚯蚓中毒癥狀；并于7d、14d各計(jì)數(shù)1次，以前尾部對機(jī)械刺激無反應(yīng)視為死亡[8].將試驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)，應(yīng)用簡明統(tǒng)計(jì)10.35（Concise Statistics,CS10.35)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理.

2 結(jié)果

2.1 濾紙接觸法測定博士1:4對蚯蚓的單一毒性

博士1:4單一污染蚯蚓表現(xiàn)出的中毒癥狀如下：在濾紙實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，蚯蚓皮膚與農(nóng)藥直接接觸，所以蚯蚓有強(qiáng)烈的反應(yīng)，非常活躍.3h到4h觀察時(shí)，則活動(dòng)減弱.7h到8h觀察時(shí)，蚯蚓身體蜷縮，抱團(tuán)聚在一起并伴有輕微中毒現(xiàn)象，身體微腫，體色略變暗.10h到12h觀察時(shí)蚯蚓中毒現(xiàn)象明顯，體色變暗為深紫色，身體縮短、蜷縮，體節(jié)特別明顯，身體及生殖環(huán)腫大.行動(dòng)明顯減弱.18h到20h觀察時(shí)蚯蚓已經(jīng)出現(xiàn)個(gè)別死亡情況，中毒現(xiàn)象嚴(yán)重，身體虛弱行動(dòng)很少.由表1可見，博士1:4的濃度為1.5g/L至4.0g/L時(shí)，污染暴露24h對蚯蚓不產(chǎn)生致死效應(yīng).當(dāng)污染暴露48h對蚯蚓表現(xiàn)明顯的致死效應(yīng).且蚯蚓死亡率隨污染濃度的增大而升高（見表1，圖1）.對表1的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以博士1:4的濃度為橫坐標(biāo)，蚯蚓的死亡率為縱坐標(biāo)，得到回歸方程如下：

D=27.049X1--27.719(R2=0.98983595,n=6,P<0.005)①

表1 博士1：4濾紙接觸法蚯蚓死亡情況

圖1 博士1：4濾紙接觸法不同濃度和時(shí)間條件下蚯蚓的死亡率

其中，D為蚯蚓死亡率（%），X1為博士1:4濃度（g/L），P為顯著性水平，R為相關(guān)系數(shù)，n為試驗(yàn)處理數(shù).根據(jù)上述方程可計(jì)算出博士:4的LC50為2.8732g/L.

2.2 自然土壤法測定博士1:4對蚯蚓的單一毒性

試驗(yàn)3d后檢查時(shí)，蚯蚓有明顯的中毒現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為身體腫大并伴有僵硬現(xiàn)象，身體縮短，體色發(fā)暗為深紫色，環(huán)節(jié)突出，活動(dòng)減少.7d時(shí)中毒現(xiàn)象與三天時(shí)一樣，但現(xiàn)象更加明顯，無死亡現(xiàn)象.但在第12d時(shí)，蚯蚓中毒現(xiàn)象略為緩解，分析可能為農(nóng)藥在土壤中藥效降解的原因所致.14d檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)蚯蚓中毒癥狀有明顯的降低趨勢，身體縮短狀況與僵硬現(xiàn)象明顯好轉(zhuǎn)，無死亡現(xiàn)象.將實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長一周后，蚯蚓中毒情況明顯減弱，未出現(xiàn)死亡情況.但由于蚯蚓在塑料盆里養(yǎng)殖時(shí)間過長，體質(zhì)變?nèi)?由于14d時(shí)蚯蚓無死亡現(xiàn)象，所以無實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).（表 2，圖 2）.

表2 博士1：4自然土壤法法蚯蚓死亡情況

圖2 博士1：4自然土壤法不同濃度和時(shí)間條件下蚯蚓的死亡率

3 討論與分析

博士1:4的主要成分二嗪磷為中毒性，具有觸殺、胃毒和一定的內(nèi)吸作用.主要適用范圍是對鱗翅目、同翅目等多種害蟲均有較好的防治效果，防治多種作物的地下害蟲.二嗪磷是廣譜性有機(jī)磷殺蟲劑，其作用機(jī)理為抑制乙酰膽堿酯酶（AChE）.AChE在蚯蚓的神經(jīng)傳遞過程中起著重要作用.AChE的活性主要用于評價(jià)有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對蚯蚓的毒性效應(yīng).這兩類農(nóng)藥均可抑制蚯蚓AChE活性，從而使蚯蚓神經(jīng)傳遞受阻[9].

3.1 濾紙接觸法測定博士1:4對蚯蚓的單一毒性

濾紙接觸法是直接將蚯蚓暴露在一定濃度的農(nóng)藥環(huán)境下的試驗(yàn)方法，簡單易行，可以初步了解化學(xué)藥品的固有毒性和對土壤動(dòng)物的潛在毒性[10].從博士1:4對蚯蚓的單一毒性試驗(yàn)結(jié)果看，在濾紙?jiān)囼?yàn)中24h和48h時(shí)，博士1:4單一毒性試驗(yàn)組的蚯蚓的LC50為2.8732g/L，博士1:4對蚯蚓的毒害隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，隨著農(nóng)藥濃度的增加而增加，說明博士1:4對蚯蚓是有毒害作用的，而蚯蚓也對博士1:4有一定的耐受能力.如果農(nóng)藥濃度過高，超出了蚯蚓的耐受能力，則會(huì)危害蚯蚓的生長和生存.

3.2 自然土壤法測定博士1:4對蚯蚓的單一毒性

在自然土壤法的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)多次提升農(nóng)藥濃度但蚯蚓在14d內(nèi)并沒有死亡情況，分析原因一方面可能是市面上的農(nóng)藥博士1:4雖然是08年以后出產(chǎn)，但生產(chǎn)所用原料全是08年所產(chǎn)，由于這些原料放置時(shí)間過長而導(dǎo)致藥效降低.另一方面，自然土壤法的特點(diǎn)是簡便易行，可用于具體地區(qū)污染物的環(huán)境安全性評價(jià)，但各地區(qū)試驗(yàn)結(jié)果可比性差[11].不同地區(qū)、環(huán)境中的土壤對藥物的降解情況有所不同.而藥物通過接觸對蚯蚓產(chǎn)生的毒性不僅取決于藥物的固有毒性，還與藥物在土壤中的狀態(tài)及在蚯蚓體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)密切相關(guān)[10].而且博士1:4是藥肥一體的農(nóng)藥，毒性成分二嗪磷含量較低，所以蚯蚓在較高的實(shí)驗(yàn)濃度下未發(fā)生死亡情況.

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，在自然土壤法中蚯蚓雖然沒有死亡情況，但有明顯的中毒現(xiàn)象，所以在農(nóng)藥濃度的選取上還有待研討.本實(shí)驗(yàn)研究將繼續(xù)進(jìn)行.

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X174

A

1673-260X（2011）03-0140-03

內(nèi)蒙古自治區(qū)教育廳高等學(xué)校研究項(xiàng)目(NJ10249);赤峰學(xué)院重點(diǎn)扶持學(xué)科項(xiàng)目資助