三角褐指藻提取生物柴油的生態(tài)響應(yīng)研究

何 峰， 傅鵬程， 徐春明

（中國石油大學(xué)（北京）新能源研究中心，北京102249）

三角褐指藻提取生物柴油的生態(tài)響應(yīng)研究

何 峰， 傅鵬程＊， 徐春明

（中國石油大學(xué)（北京）新能源研究中心，北京102249）

為了考察光暗對比以及不同碳源類型和濃度對于三角褐指藻生化物質(zhì)的影響，用含有葡萄糖、乙酸鈉和甘油的培養(yǎng)基對三角褐指藻（Phaeodactylumtricornutum）進(jìn)行培養(yǎng)，并測定生物量、細(xì)胞濃度、生化物質(zhì)以及脂肪酸含量。結(jié)果表明，三角褐指藻具有光自養(yǎng)和兼養(yǎng)生長的能力；三角褐指藻對底物濃度與有機(jī)碳源具有選擇性，其中利用葡萄糖的最佳濃度為20mmol/L；在500mL三角瓶培養(yǎng)過程中生長適宜條件為：溫度（25±1）℃，光強(qiáng)25 μmol/（m2·s），pH為7.5。不管哪種碳源均能夠促進(jìn)三角褐指藻生物量的積累。將細(xì)胞濃度達(dá)到2.5×106個/mL培養(yǎng)末期的藻液進(jìn)行蛋白質(zhì)、還原糖、葉綠素以及總脂（TOL）含量分析，考察不同生長條件下生化物質(zhì)的積累以及細(xì)胞生物量的變化。通過超聲波萃取及索氏抽提總脂，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到20%（干重）；利用GC－MS分析脂肪酸含量及組成，其中以C16∶1，C16∶0居多，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為34.8%，11.9%，可以用于提取生物柴油。

三角褐指藻； 有機(jī)碳源； 光暗對比； 葡萄糖； 生物量； 總脂含量； 生物柴油

微藻是一類具有生產(chǎn)高附加值化學(xué)和營養(yǎng)品如多不飽和脂肪酸（PUFAs）和生物活性成分的有潛力的資源［1］。同時做為原料生產(chǎn)生物柴油等生物質(zhì)燃料受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注，微藻因其具有生長速度快、脂肪酸含量高、生長條件溫和、不受水質(zhì)、自然環(huán)境等影響而被認(rèn)為是值得推廣的第三代生物質(zhì)燃料。硅藻三角褐指藻富含油脂（占細(xì)胞干重40%～60%）［2］，且短鏈脂肪酸（C14和Cl6）占細(xì)胞中總脂肪酸的67%～70%［3］。

三角褐指藻富含大量的多不飽和脂肪酸和色素等，如二十碳五烯酸（EPA），具有很高的經(jīng)濟(jì)利用價值［4］。也有報道稱國外已用三角褐指藻生產(chǎn)抗氧化劑（巖藻黃素）等產(chǎn)品［5］，關(guān)于它的研究國內(nèi)進(jìn)行了大量的工作，如對溫度、光強(qiáng)、時間、營養(yǎng)鹽及微量元素等進(jìn)行了探討。暨南大學(xué)段舜山課題組分別利用不同氮源［6］、不同鐵濃度誘導(dǎo)海洋三角褐指藻的生長進(jìn)行了研究［7］，梁英等［8］研究了溫度對于三角褐指藻葉綠素?zé)晒馓匦砸约吧L的影響，也有研究利用不同溫度考察三角褐指藻的生長以及甘油三酯的積累情況，并且利用絮凝法收集藻種，提高了藻種的收集效率，另外，海洋微藻在受到環(huán)境脅迫后，如氮限制［9－12］、超聲波、紫外光等對微藻的化學(xué)組成也產(chǎn)生了很大的影響［13］。目前已經(jīng)有許多報道藻類的兼養(yǎng)培養(yǎng)比光自養(yǎng)培養(yǎng)生長速度快。例如在戶外管式反應(yīng)器中以0.1mol/L葡萄糖為底物兼養(yǎng)培養(yǎng)小球藻白天最高產(chǎn)量達(dá)到10.2g/（L·d），晚上達(dá)到5.9g/（L·d），比正常情況下小球藻類似的光自養(yǎng)產(chǎn)量要高三倍。兼養(yǎng)培養(yǎng)是光自養(yǎng)生產(chǎn)生物質(zhì)的一種轉(zhuǎn)換，生長速率及生物量的增加是光和無機(jī)物作用的結(jié)果。然而目前國內(nèi)對于硅藻三角褐指藻在油脂積累以及代謝方面的研究較少，本研究以大規(guī)模培養(yǎng)三角褐指藻并且分析其脂肪酸含量及組成為目標(biāo)，采用兼養(yǎng)培養(yǎng)的方式是目前研究較少的培養(yǎng)方式，因其高效且脂肪含量相對較高而體現(xiàn)了創(chuàng)新性與可操作性。

1 實驗部分

1.1 材料與方法

1.1.1 藻種來源 中國科學(xué)院海洋研究所購得三角褐指藻藻種。

1.1.2 培養(yǎng)條件 人造海水配置f/2培養(yǎng)基配方為：NaNO3，74.8mg；NaH2PO4，4.4mg；Na2SiO3·9H2O，8.4～16.7mg；f/2微量元素溶液，1mL；f/2維生素溶液，1mL；海水，1 000mL。其中f/2微量元素溶液基本配方為：ZnSO4·4H2O，23mg；MnCl2·4H2O，178mg；CuSO4·5H2O，10mg；FeC6H5O7·5H2O，3.9g；NaMoO4·2H2O，7.3 mg；CoCl2·6H2O，12mg；Na2EDTA，4.35g。f/2維生素溶液基本配方：維生素B12，0.5mg；維生素B1，100mg；維生素H，0.5mg；純水，1 000mL。鹽度3%，pH＝7.5，藻種密度0.15g/L，光照培養(yǎng)箱25℃，光照5 000lux，光照時間為16h（暗反應(yīng)時間為8h），培養(yǎng)14d，同時進(jìn)行暗反應(yīng)對照。對數(shù)生長期的藻種進(jìn)行接種，每組實驗3個平行，每天定期搖動3次，并隨機(jī)變換位置，使吸收光照均勻。所有實驗均在中國石油大學(xué)（北京）光合資源化利用實驗室開展。

1.1.3 儀器設(shè)備 紫外分光光度計（Unico上?？茖W(xué)儀器廠）；高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實驗儀器廠）；光照培養(yǎng)箱（上?？茖W(xué)儀器廠）；超聲波破碎儀（上海德強(qiáng)醫(yī)學(xué)儀器公司）；光強(qiáng)測定儀（LI－250）；超凈工作臺（哈東聯(lián)科學(xué)儀器廠）；磁力攪拌器（江蘇太倉科學(xué)儀器廠）；恒溫?fù)u床（江蘇太倉科學(xué)儀器廠）。

1.2 實驗方法

1.2.1 收集培養(yǎng) 采用500mL的搖瓶進(jìn)行培養(yǎng)，同時后期利用10L光合生物反應(yīng)器進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，收集培養(yǎng)至對數(shù)生長末期的藻液5 000g，4 000r/min離心10min，收集藻細(xì)胞，蒸餾水洗滌3次，收集藻粉，烘干，于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 生物量的測定 采用干重法測定。將恒重的濾膜抽濾一定體積的藻液，80℃恒溫烘干24h，測定質(zhì)量無變化后測定濾膜的質(zhì)量差，即可獲得細(xì)胞的生物量。

1.3 還原性糖、葉綠素a以及蛋白質(zhì)含量的測定

1.3.1 還原性糖測定 采用DNS，每兩天測定一次485nm下的吸光度，通過查找標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)的數(shù)值來確定還原糖類的變化。同時考察不同糖類在代謝過程中底物的消耗情況。

1.3.2 葉綠素a含量的變化 收集經(jīng)4 000r/min，離心5min后所得到的藻種，凍干24h，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%丙酮進(jìn)行萃取，葉綠素是一種檢測光合效率的手段，葉綠素?zé)晒夥謩e在645nm和663 nm處有最大吸收，質(zhì)量濃度＝（2 0.2×OD645＋8.02×OD663）×稀釋倍數(shù)［15］。

1.3.3 蛋白質(zhì)的測定

（1）細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的提?。河脦Э潭鹊碾x心管量取一定體積的藻液，在5 000r/min下離心10 min，小心吸取上清液，余下的藻泥用蒸餾水定容至10mL，用超聲波細(xì)胞粉碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎，5 000 r/min下離心10min，將上清液移入比色管中，即得蛋白質(zhì)提取液。

（2）細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的測定方法：細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的含量用紫外吸收法測定。取蛋白質(zhì)的提取液置于光徑1cm的石英比色杯中，測定其在280nm和260nm的波長，分別讀取。用蒸餾水做空白對照。根據(jù)下列公式計算藻液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度：質(zhì)量濃度＝1.55A280－0.76A260，根據(jù)藻液的濃縮比和對應(yīng)生物量計算出蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.3.4 總脂含量的測定 將收集的藻種進(jìn)行離心烘干，分別取0.5g干藻種用正己烷進(jìn)行萃取，后將藻種進(jìn)行超聲波破碎5min，并導(dǎo)入新的離心管，用N2吹干正己烷，稱重計算總脂的含量。

1.4 脂肪酸的提取

在螺口試管中稱取烘干的藻粉5 0mg，加入2.0mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的H2SO4甲醇溶液，充入氮氣。將螺口試管放入80℃砂浴1h，冷卻至室溫，分別加入10mL的蒸餾水和1.0mL的正己烷，充分振蕩，4 000r/min離心5min。取出正己烷層放置到一小玻璃瓶中，氮氣吹干，加入100μL正己烷。轉(zhuǎn)移到另一個小玻璃瓶中，封口備測。

1.5 脂肪酸組成的測定

利用Finnigan Trace DSQ氣質(zhì)聯(lián)用儀分析脂肪酸組成以及含量。毛細(xì)管色譜柱HP－5（30m×320μm×0.25μm，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的苯酚）。進(jìn)樣口溫度為270℃，掃面范圍50～600u；55℃保持1 min，以30℃/min的速度升至175℃，以2℃/min的速度升至240℃，再以6℃/min的速度升至300℃，在300℃保持10min。離子源為電子轟擊源（EI，70eV），載氣為高純氦氣，流速1mL/min，以面積歸一化法得到各脂肪酸組分的相對百分含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 藻類細(xì)胞密度以及生物量的變化

2.1.1 不同有機(jī)碳源對藻類生長的影響

（1）細(xì)胞密度的變化

各對照組均以0.15g/L的藻密度進(jìn)行接種。在不同的有機(jī)碳源以及不同濃度下進(jìn)行對照試驗，以不加有機(jī)碳源的光反應(yīng)為對照組，同時考察暗反應(yīng)條件下，藻液的生長情況，如圖1所示。

從圖1（a）中可以看到隨著時間的變化，細(xì)胞生物量呈線性增加，不同的葡萄糖濃度對于藻類細(xì)胞密度的影響有所不同，其中20mmol/L的葡萄糖濃度最適合藻細(xì)胞密度的增加，從5～100mmol/L的趨勢內(nèi)變化顯著。圖1（b）中含5～50mmol/L的乙酸鈉的培養(yǎng)基對細(xì)胞生物量的增加均有顯著提高，并且隨著時間的變化成線性趨勢，當(dāng)乙酸鈉濃度達(dá)到100mmol/L時，細(xì)胞密度變化很小，說明該濃度會抑制細(xì)胞的生長，而5mmol/L乙酸鈉滿足生長需求。圖1（c）中添加不同甘油均使藻細(xì)胞在兼養(yǎng)條件下細(xì)胞密度有所提高，但是不同的添加濃度對于細(xì)胞密度的增加趨勢變化不明顯。圖1（d）中將光反應(yīng)與暗反應(yīng)進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，在黑暗脅迫條件下，細(xì)胞的生長受到了嚴(yán)重抑制，細(xì)胞密度變化很小，因此說明黑暗條件不適合三角褐指藻的生長，而光自養(yǎng)與光兼養(yǎng)均能適合三角褐指藻生長。

Fig.1 Effect of algae cell density with different organic carbon source圖1 不同有機(jī)碳源對藻類細(xì)胞密度的影響

（2）藻種的生物量變化

培養(yǎng)到第14d時，通過干重法測定細(xì)胞的生物量，結(jié)果如表1所示。

在25℃，每天光照16h的500mL培養(yǎng)瓶中進(jìn)行自養(yǎng)、異養(yǎng)、以及兼養(yǎng)培養(yǎng)的對比，發(fā)現(xiàn)兩組對比試驗中添加有機(jī)碳源其生物量均有增加，并且在光兼養(yǎng)條件下生物量增加顯著，最高可達(dá)到1.001 mg/mL。

表1 正常光照條件以及暗反應(yīng)條件下細(xì)胞生物量的積累Table 1 Biomass of microalgae between normal and darkness mg/mL

2.2 細(xì)胞內(nèi)生化物質(zhì)及生化組成的變化

細(xì)胞內(nèi)生化物質(zhì)隨時間的變化如圖2所示。葉綠素a體現(xiàn)了藻類光合效率以及光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的關(guān)系，從實驗中可以看到光自養(yǎng)與暗反應(yīng)間葉綠素a含量變化很大（見圖2（a）），隨著時間的增長，光反應(yīng)葉綠素a一直積累，以葡萄糖為底物的異養(yǎng)反應(yīng)中最大值可達(dá)到0.69mg/L，是光反應(yīng)的1.9倍，3種底物所積累的葉綠素含量接近；以葡萄糖為底物的暗反應(yīng)最大值只有0.45mg/L，而暗反應(yīng)條件下不加有機(jī)碳源，葉綠素a積累更少，只在第6天達(dá)到最大值0.17mg/L，而后逐漸減少，到第10天基本上不變化。

還原性糖類可以間接地反映藻類糖代謝的合成、轉(zhuǎn)移等信息。由圖2（b）分析可知，不投加有機(jī)碳源的光反應(yīng)中糖類從第4天開始增加，到第12天達(dá)到最大值為0.35mg/L，之后不變化，到第12天開始減少，第14天質(zhì)量濃度只有0.29mg/L，分析原因可能是開始消耗底物的還原糖類；而黑暗脅迫條件下還原糖類積累很少，最大值只有光反應(yīng)的0.6倍。而對于不同的反應(yīng)條件包括光自養(yǎng)、異養(yǎng)和光兼養(yǎng)以及黑暗對照發(fā)現(xiàn)，光兼養(yǎng)條件下消耗的底物質(zhì)量濃度最大，而光自養(yǎng)比黑暗脅迫條件下所積累的還原糖多2.9倍。

Fig.2 Chemical position changes as the time圖2 化學(xué)組成隨時間的變化

由圖2（c）分析可知，光反應(yīng)第4天開始，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度顯著增加，到第10天達(dá)到最大值0.71 mg/L，而最小值只有0.11mg/L，黑暗脅迫條件下蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度變化不顯著，第4天達(dá)到最大值0.20mg/L，之后逐漸較小。可以看出，暗反應(yīng)中細(xì)胞的代謝和分裂都非常緩慢，因此物質(zhì)積累很少。

2.3 不同有機(jī)碳源對脂肪酸組分及含量的影響

通過GC－MS分析脂肪酸組成及其含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），結(jié)果如表2所示。

表2 脂肪酸含量與類型Table 2 The type and content of fatty acid%

續(xù)表2

三角褐指藻在不同的培養(yǎng)條件下脂肪酸含量變化顯著，而且不飽和脂肪酸的類型有所不同，主要的脂肪酸為C16∶0，C16∶1，C20∶5，還有部分C18（C18∶1，C18∶2，C18∶3，C18∶4），其中兼養(yǎng)條件下的脂肪酸含量明顯高于自養(yǎng)，總飽和脂肪和單不飽和脂肪酸含量在兼性條件下有所增加，多不飽和脂肪酸有所下降。

綜上，通過考察光暗對比發(fā)現(xiàn)，暗反應(yīng)條件對三角褐指藻的生長、生物量、細(xì)胞密度以及化學(xué)成分如蛋白質(zhì)、還原糖、脂類積累等均有較大的影響，特別是在實驗結(jié)束的前4天，光照條件下細(xì)胞密度隨著時間增加變化顯著，而黑暗條件下細(xì)胞密度僅為33%，而且蛋白質(zhì)、糖類、葉綠素均出現(xiàn)減少，原因是暗反應(yīng)條件下細(xì)胞分裂減慢，導(dǎo)致生物化學(xué)物質(zhì)合成能力下降。在14天的實驗過程中，黑暗條件下的三角褐指藻仍能夠緩慢生長并在實驗結(jié)束時保持相對穩(wěn)定的活性，說明三角褐指藻有一定的耐受黑暗脅迫的能力，從而在惡劣環(huán)境中生存。通過實驗發(fā)現(xiàn)，三角褐指藻可以適應(yīng)不同的有機(jī)碳源，并且具有最適合的底物濃度，同時對黑暗脅迫具有一定的耐受力，這也導(dǎo)致了其在暗反應(yīng)過程中有少部分葉綠素、糖類、蛋白質(zhì)的代謝和合成。需要進(jìn)一步研究不同的溫度、氮含量等條件對于生化物質(zhì)及脂類積累的影響，從而充分利用三角褐指藻獲得相關(guān)的生物柴油及相關(guān)產(chǎn)品。

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（Ed.：YYL，Z）

Technology of Phaeodactylum Tricornutum to Extract Fatty Acid for the Biodiesel Production

HE Feng，F(xiàn)U Peng－cheng＊，XU Chun－ming
（Research Center of Renewable Energy，China University of Petroleum（Beijing），Beijing102249，P.R.China）

In order to understand the effect of light，carbon sources and concentration on thephaeodactylumtricornutum，the culture medium containing glucose，acetate and glycerol were chose，the biomass，cell concentration，biochemical substances and fatty acid content were tested.The results show that thephaeodactylumtricornutumis photoautotroph and mixotroph，which with selectivity for substrate concentration and organic carbon sources，the optimum concentration of glucose is 20 mmol/L，the optimal growth condition in 500mL flask contains that the temperature is（25±1）℃，the light intensity is 50 μmol/（m2·s），the pH is 7.5.Whatever the carbon sources are able to promote the biomass accumulation.When the cell concentration achieve to 2.5×106cells/mL in the evening of the culture，the protein，sugar，chlorophyll and TOL content were analyzed.The biomass accumulation and biomass change in different growth conditions were determined.By ultrasonic extraction and Soxhelt extraction，the total of lipid reaches 20%（dry weight）；The fatty acid content and composition with GC－MS were measured，and found the C16∶0and C16∶1are 34.8%and 11.9%（mass fraction）respectively，which are more than other components and could be used to extract bio－diesel.

Phaeodactylumtricornutum；Organic carbon source；Light/darkness；Glucose；Biomass；Total liquid；Biodiesel

TE39

A

10.3696/j.issn.1006－396X.2011.01.001

2010－10－27

何峰（1983－），男，黑龍江賓縣，在讀博士。

國家973科技計劃項目資助（S2010021001）。

＊通訊聯(lián)系人。

1006－396X（2011）01－0001－05

Received27October2010；revised11November2010；accepted20December2010

＊Corresponding author.Tel.：＋86－10－89731091；e－mail：hefeng20024406＠126.com