液體發(fā)酵中木聚糖酶的研究

張 宇,王志成,周紅霞

（黑龍江省能源環(huán)境研究院，黑龍江哈爾濱，150027）

木聚糖是植物半纖維素的重要組分，在植物細(xì)胞壁中的含量?jī)H次于纖維素，約占細(xì)胞干重的35%[1]，是一種高度異構(gòu)的雜聚糖，很難被分解，自然界中有很大一部分木聚糖未被有效利用，造成了極大的資源浪費(fèi)。

木聚糖酶是一類能夠特異降解木聚糖的酶類，主要是由β-1，4-D-內(nèi)切木聚糖酶和β-1，4-D-外切木糖苷酶組成，此外還有一些脫支鏈酶。木聚糖酶能夠降解木聚糖生成聚合度為2～10的低聚木糖混合物，該產(chǎn)物具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此近年來(lái)，木聚糖酶在造紙工業(yè)、食品、能源、飼料以及環(huán)境等領(lǐng)域均顯示了廣闊的應(yīng)用前景[2]。

木聚糖酶在去污洗滌，醫(yī)藥等行業(yè)中也有應(yīng)用。另?yè)?jù)報(bào)道，木聚糖酶在果實(shí)成熟、種子萌發(fā)、真菌的寄生及植物的抗性等諸多生理過(guò)程中也有重要作用[3]。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌株

好食脈孢霉（N.sitopHila），齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院生化工程實(shí)驗(yàn)室保藏提供，斜面（PDA）培養(yǎng)基保存。

1.2 主要儀器

電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器廠）,DL102電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠）,壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）,超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備股份公司）,光學(xué)顯微鏡（Olympus），血球計(jì)數(shù)板（國(guó)營(yíng)上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠），UV-120-02紫外分光光度計(jì)（日本津島），酸度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），HYG-Ⅲ回旋式恒溫調(diào)速搖瓶柜（上海新蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司），電子萬(wàn)用爐（天津市泰斯特儀器有限公司），微量移液器（荊花）。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 斜面培養(yǎng)基（PDA）

馬鈴薯200g去皮，切塊煮沸30min，然后用紗布過(guò)濾，再加葡萄糖20g及瓊脂20g，溶化后用水定容至1000mL，pH自然。

1.3.2 種子培養(yǎng)基：

3%麩皮水（麩皮水制備∶3g麩皮加水100mL,浸泡1h,煮沸 1h,過(guò)濾取汁、定容）、1.5%蛋白胨、pH5.0。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

3%麩皮水、0.5%蛋白胨、6%豆渣、pH自然。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)方法

2.1.1 斜面培養(yǎng)

取好食脈孢霉一支，打開(kāi)后用接種環(huán)轉(zhuǎn)入PDA斜面培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)3d，放入冰箱中備用。

2.1.2 液體種子培養(yǎng)

向保存的好食脈孢霉斜面中加入5～10mL無(wú)菌水，然后用接種針將培養(yǎng)基表面的菌落刮下，轉(zhuǎn)入帶玻璃珠的三角瓶中，震蕩搖勻，制成孢子懸液，用顯微鏡計(jì)數(shù)后，再取適量的懸液接入裝有50mL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，使其孢子數(shù)達(dá)到105個(gè)/mL,于28℃，150r/min 下震蕩培養(yǎng)[4～6]。

2.1.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)

將液體種子接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于一定的轉(zhuǎn)速和溫度的回轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)，每個(gè)做三個(gè)平行樣，并定時(shí)取樣測(cè)定酶活力。

2.2 粗酶液的提取及酶活單位定義

將發(fā)酵液用濾紙真空抽濾后所得的清液，即為粗酶液。

酶活力定義為：在45℃，pH4.4條件下，每分鐘分解木聚糖生成1μmol木糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

2.3 木聚糖酶活力測(cè)定

木聚糖酶活力的測(cè)定常用方法有：Na3AsO4法、液相色譜法、DNS法，其中最常用的為DNS法,本文采用3，5- 二硝基水楊酸法（DNS）法[5～6]。

底物為0.4%木聚糖溶液（pH4.4），取0.5mL適當(dāng)稀釋的酶液于比色管中，加入1.5mL底物溶液，45℃水浴反應(yīng)30min，加入1.5mLDNS溶液后在沸水浴中煮沸5min。迅速用冷水冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25mL，540nm測(cè)定吸光值。

空白對(duì)照：取0.5mL適當(dāng)稀釋的酶液于比色管中，煮沸5min使酶失活，加入1.5mL底物溶液，45℃水浴反應(yīng)30min，加入1.5mLDNS溶液后在沸水浴中煮沸5min。迅速用冷水冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25mL，540nm測(cè)定吸光值。

X（mg）∶反應(yīng)結(jié)束時(shí)酶水解底物產(chǎn)生的還原糖的毫克數(shù)；

Y（mL/g）∶酶的稀釋倍數(shù)；

150.13 （mg/mmol）∶木糖的相對(duì)分子質(zhì)量；

30（min）∶反應(yīng)時(shí)間（min）；

0.5 （mL）∶加入酶液量；

1000∶將mmol轉(zhuǎn)化成μmol所乘的系數(shù)。

3 影響酶活力的因素

3.1 培養(yǎng)基對(duì)酶活力的影響

以3%麩皮水為碳源，分別以0.5%蛋白胨、6%濕豆渣、1.4%豆粕、0.5%蛋白胨和6%濕豆渣及0.5%蛋白胨和1.4%豆粕為氮源，發(fā)酵溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為150r/min，初始pH值自然進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，選擇接種量為3%,每組三個(gè)平行，發(fā)酵72h后測(cè)酶活。

3.2 接種量對(duì)酶活力的影響

發(fā)酵溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為150r/min、初始pH值自然條件下，分別選擇接種量為0.5%、1%、3%、5%、7%，每組三個(gè)平行，發(fā)酵72h后測(cè)酶活。

3.3 發(fā)酵溫度對(duì)酶活力的影響

分別選取發(fā)酵溫度20℃、25℃、28℃、32℃、轉(zhuǎn)速為150r/min、初始pH值自然進(jìn)行液體發(fā)酵，選擇接種量為3%,每組三個(gè)平行，發(fā)酵時(shí)間為72h，測(cè)定各溫度下的酶活力。

4 結(jié)果與討論

4.1 種子培養(yǎng)

在溫度為28℃，轉(zhuǎn)速150r/min、初始pH值為5.0的條件下培養(yǎng)48h，每4h取樣一次，烘干至恒重，測(cè)干重，各發(fā)酵時(shí)間的菌體干重如表4-1所示。

如表1所示，在12～32h后的種子培養(yǎng)液中菌體含量明顯增多，適宜接種到發(fā)酵培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

表1 各發(fā)酵時(shí)間的菌體干重Table 1 The dry weight at various fermentation time

4.2 不同培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基是提供微生物生長(zhǎng)繁殖和生物各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。

按表2配制發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為150r/min，初始pH值自然。進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間為72h。

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基Table 2 Fermentation medium

表3 各發(fā)酵培養(yǎng)基的木聚糖酶活力Table 3 The activities of xylanase produced by different fermentation mediums

各發(fā)酵培養(yǎng)基的木聚糖酶活力，如表3。4號(hào)培養(yǎng)基木聚糖酶活力相對(duì)較高，但是總的來(lái)說(shuō)酶活力低，無(wú)法用于實(shí)際生產(chǎn)中。從4號(hào)和5號(hào)培養(yǎng)基可以看出豆渣更適合為這個(gè)菌株提供氮源，所以決定由豆渣提供氮源，考慮加大培養(yǎng)基中氮源的量，即豆渣的含量，并且同時(shí)加入直接碳源葡萄糖，看直接碳源和氮源量的變化是否對(duì)菌株產(chǎn)木聚糖酶活力有影響。

表4 不同豆渣含量的培養(yǎng)基Table 4 The culture mediums contains different dosages of bean dregs

豆渣含量不同的培養(yǎng)基木聚糖酶活力如表5。

表5 不同豆渣含量培養(yǎng)基的木聚糖酶活力Table 5 The activities of xylanase produced by culture mediums with different bean dregs contents

如從表5所示結(jié)果，直接碳源葡萄糖對(duì)木聚糖酶活力沒(méi)有影響，并且不加蛋白胨只加豆渣的培養(yǎng)基產(chǎn)的木聚糖酶活力是無(wú)法達(dá)到加入蛋白胨的培養(yǎng)基產(chǎn)的木聚糖酶活力的。所以，選擇發(fā)酵培養(yǎng)基為3%麩皮水、0.5%蛋白胨、6%豆渣、pH自然。

4.3 不同接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

接種量是指種子培養(yǎng)液體積和發(fā)酵液體積之比。本實(shí)驗(yàn)選取在溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為150r/min、初始pH值自然條件下，分別選擇接種量為0.5%、1%、3%、5%、7%進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，在72h取樣測(cè)酶活。本實(shí)驗(yàn)研究不同接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響，木聚糖酶活力如表6。

表6 不同接種量的木聚糖酶活力Table 6 The activities of xylanase produced with different inoculating dosages

如表6所示，接種量以1%最佳，此時(shí)產(chǎn)生的木聚糖酶活力最高。接種量過(guò)低，所需要的培養(yǎng)周期長(zhǎng)，木聚糖酶活力降低；接種量過(guò)高，雖然培養(yǎng)時(shí)間縮短，但木聚糖酶活力達(dá)不到最佳值。

4.4 不同培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

本實(shí)驗(yàn)分別選取發(fā)酵溫度 20℃、25℃、28℃、32℃、轉(zhuǎn)速為150r/min、初始pH值自然進(jìn)行液體發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為72h。測(cè)定各溫度下的酶活力如表7。

表7 不同溫度的木聚糖酶活力Table 7 The activities of xylanase produced at different temperature

如表7所示，溫度對(duì)該菌木聚糖酶的產(chǎn)生有顯著影響。培養(yǎng)溫度為25～28℃時(shí)，有利于木聚糖酶的合成，此時(shí)木聚糖酶活力較高。低于25℃時(shí)溫度偏低，菌體生長(zhǎng)較慢，產(chǎn)酶活力較低，所以選擇在28℃下發(fā)酵。

5 總 結(jié)

本實(shí)驗(yàn)研究表明合理的碳氮比對(duì)好食脈孢霉產(chǎn)木聚糖酶有很大的影響，合理的碳氮比有利于木聚糖酶的合成。

實(shí)驗(yàn)研究表明脈孢霉在3%麩皮水、1.5%蛋白胨、pH5.0的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，搖瓶轉(zhuǎn)速150r/min，發(fā)酵溫度為28℃條件下培養(yǎng)12～32h后的種子培養(yǎng)液適宜接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中。

液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為：3%麩皮水、0.5%蛋白胨、6%豆渣、pH自然。最適接種量為1%（v/v），最適發(fā)酵溫度為28℃。

本實(shí)驗(yàn)用的好食脈孢霉菌種，相對(duì)產(chǎn)孢子多，菌體生長(zhǎng)旺盛，但木聚糖酶的產(chǎn)量不是很高，有待于進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞破碎后木聚糖酶的活力進(jìn)行研究。液態(tài)發(fā)酵接種量和溫度的控制對(duì)木聚糖酶的產(chǎn)量有很重要的影響。

∶

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