豬 K88 、K99 、987P、F41 埃希氏大腸桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)的初步探討

巫月生,齊冬梅,張毓金,賴月輝,李嘉愛,王卓明

(廣東永順生物制藥有限公司,廣州蘿崗 511356)

仔豬大腸桿菌性腹瀉是由產(chǎn)腸毒素埃希氏大腸桿菌(ETEC)引起的哺乳仔豬急性腸道傳染病,新生仔豬 ETEC的 4個重要的黏附素是 F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)和 F41[1],其是引起初生仔豬腹瀉(即仔豬黃痢)的關(guān)鍵因素[2],臨床表現(xiàn)為仔豬出生后 1～3 d感染,引起劇烈腹瀉而迅速死亡,死亡率高達 100%。本病對初建種豬場的初產(chǎn)母豬的仔豬危害較大,多年來,國內(nèi)有關(guān)研究單位已開發(fā)了單價滅活苗,二價基因工程苗,三價菌毛滅活苗及多價滅活菌苗[3-4],但都存在使用覆蓋面窄或免疫原性差,效價不穩(wěn)定等問題。疫苗效價很大程度上取決于疫苗中有效抗原的量,菌毛抗原是致病性大腸桿菌主要抗原成分,已知菌毛抗原表達除與菌株、培養(yǎng)基等有關(guān)[5]外,培養(yǎng)方法亦至關(guān)重要,本研究選擇含 K88、K99、987P、F41的四株豬埃希氏大腸桿菌,采用高密度發(fā)酵培養(yǎng)方法表達菌毛抗原取得了較好效果,為制備高效疫苗打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株 豬埃希氏大腸桿菌 C83549(K88)、C83644(K99)、C83710(987P)、C83707(F41)四株菌均由廣東永順生物制藥有限公司研發(fā)部保存、提供。

1.2 血清 K88、K99、987P、F41標(biāo)準(zhǔn)血清,購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。兔抗 K88、K99、987P、F41四株菌毛抗原血清均由廣東永順生物制藥有限公司研發(fā)部制備并保存。

1.3 培養(yǎng)基及其他試劑 普通瓊脂、改良 Minca瓊脂、改良 Minca湯、葡萄糖液、2M氨水、2M HCl等,均按常規(guī)方法配制。

1.4 抗體致敏綿羊紅血球 參照《實用免疫學(xué)》[6]間接血凝試驗方法制備。

1.5 試驗用主要設(shè)備、儀器 BIOSTATR○C22型全自動生物發(fā)酵罐,容積 22 L,購自德國貝朗B.Braun公司；紫外 -可見光光度計(Ultrospe 3300pro),購自 Amersham Pharmacia Biotech公司；pHS-3C數(shù)字式 pH計,購自上海雷磁儀器廠。

1.6 種子的制備 將各株菌種分別接種在改良Minca瓊脂平板上,37℃培養(yǎng) 18 h,選取灰蘭色、半透明、圓整、凸起、濕潤和邊緣整齊的典型菌落,做平板凝集,應(yīng)達到 ++++(判定方法參照《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[7]凝集反應(yīng)強度標(biāo)準(zhǔn)),并再接種到改良 Minca瓊脂扁瓶,37℃培養(yǎng)18 h,用改良 Minca湯洗下,做平板凝集,達到 ++++,經(jīng)純檢合格后作基本種子液。

1.7 菌液培養(yǎng)

1.7.1 高密度發(fā)酵培養(yǎng) 將占高密度發(fā)酵罐 2/3至 3/4容積的改良 Minca湯及適量的消泡劑加入罐體中,116℃消毒 30 min。消毒完畢后待罐內(nèi)培養(yǎng)基溫度降為 37℃時,保持 12～24 h進行無菌檢驗。無菌檢驗合格后接入種子液,在培養(yǎng)過程中,通過高密度發(fā)酵罐自動補入葡萄糖液,用 2 mol/L氨水與 2mol/LHCl調(diào)節(jié)酸堿度,使其保持適宜的pH值和細菌快速分裂生長繁殖所需的營養(yǎng)成分,培養(yǎng)時溫度始終維持在 37℃,并控制一定通氣量和攪拌速度。

1.7.2 普通深層通氣培養(yǎng)[8]培養(yǎng)基及其裝量、種子液、pH值等與前面 1.7.1相同,對 K88、K99、987P、F41四株菌采用傳統(tǒng)普通 20 L玻璃瓶深層通氣培養(yǎng),在培養(yǎng)過程中,只通入相同的氣量,溫度始終維持在 37℃。

1.8 培養(yǎng)液檢測 規(guī)定接種后開始培養(yǎng)時的時間為 0 h,以后每隔 1 h取樣一次,所取的樣品分別用紫外 -可見光光度計(Ultrospe 3300pro)測 OD值(λ=525 nm)；用 pHS-3C數(shù)字式 pH計測 pH值。培養(yǎng)結(jié)束時,并用傾注平板培養(yǎng)法[9]測活菌數(shù)和用96孔板做反向間接血凝試驗(RIHA)[6]測效價。而對于普通深層通氣培養(yǎng),只在其培養(yǎng)結(jié)束時測定活菌數(shù)和效價。

2 結(jié) 果

2.1 四株菌培養(yǎng)不同時間各參數(shù)測定結(jié)果 K88、K99、987P、F41四株菌采用兩種不同培養(yǎng)方法培養(yǎng),測得其培養(yǎng)液在不同時間的活菌數(shù)、OD值、pH值、效價,如表 1所示。

2.2 四株菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)生長曲線的測定結(jié)果以菌液的 OD值為縱坐標(biāo),以生長時間為橫坐標(biāo),描繪出高密度發(fā)酵培養(yǎng)菌液的 OD值與時間的關(guān)系曲線,如圖 1所示。

表 1 四株菌培養(yǎng)不同時間的活菌數(shù)、OD值、pH值、RIHA效價測定的結(jié)果

圖 1 四株菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)菌液的OD值與時間的關(guān)系曲線

2.3 高密度發(fā)酵與普通深層通氣培養(yǎng)比較試驗結(jié)果 K88、K99、987P、F41四株菌采用高密度發(fā)酵與普通深層通氣兩種方法培養(yǎng)結(jié)束時,所需時間及培養(yǎng)液的活菌數(shù)與效價,如表 2所示。

表 2 四株菌用不同方法培養(yǎng)結(jié)束時間、菌液的活菌數(shù)及效價比較

3 討 論

3.1 一般細菌發(fā)酵培養(yǎng),隨著培養(yǎng)時間延長,反映細菌濃度的 OD值增高,細菌代謝產(chǎn)物也相應(yīng)增多,其 pH值發(fā)生變化的同時抑制細菌本身增殖。高密度發(fā)酵培養(yǎng)能自動調(diào)節(jié)罐內(nèi)的營養(yǎng)成分及酸堿度,盡管隨著營養(yǎng)成分消耗及代謝產(chǎn)物增加,其pH值基本穩(wěn)定在 7.0～7.2,這樣就可使細菌處于適宜的環(huán)境中快速分裂生長,呈對數(shù)生長的菌數(shù)大幅度增加,在短時間(7～8 h)內(nèi)就可達到細菌生長繁殖的高峰期,病原菌在此時,其致病力最強[10],抗原表達量亦較高。

3.2 高密度發(fā)酵培養(yǎng) 7～8 h,活菌數(shù)為 4.1×1010～4.9×1010CFU/m L,效價高達 211～213；而采用普通深層通氣培養(yǎng) 13～14 h,活菌數(shù)為 0.51×1010～0.59×1010CFU/m L,效價為 24～25。說明無論是活菌數(shù)或是抗原表達量(即效價),前者培養(yǎng)方法都遠優(yōu)于后者。所以采用高密度發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)不但減少培養(yǎng)時間,而且能很好地增加單位抗原量,便于大批量生產(chǎn)。

3.3 本試驗高密度發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果是根據(jù) K88、K99、987P、F41四菌株培養(yǎng)至 7～8 h或 6～7 h菌液的 OD值變化不大時進行收獲的,培養(yǎng)更長時間未作試驗,效價是否會隨著培養(yǎng)時間的延長還會提高,有待進一步探討。

3.4 四菌株培養(yǎng)至結(jié)束時,OD值均比較穩(wěn)定,此時細菌活菌數(shù)亦高,培養(yǎng)中當(dāng) OD值達到穩(wěn)定值時,可能就是細菌生長高峰期。因此,細菌培養(yǎng)過程中,可否以測定 OD值在其穩(wěn)定時段作為依據(jù)來確定終止培養(yǎng),此外,用不同 OD值表示抗原量與對動物免疫反應(yīng)等的相關(guān)問題還有待進一步研究。

[1] Barbara EStraw,Jeffery JZimmerman,Sylvie D,Allaire,等.豬病學(xué)[M].趙德明,張仲秋,沈建忠,譯.第 9版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2008：724.

[2] 雷夢珍,郭湘霞.仔豬大腸桿菌性腹瀉 K88,K99,987P三價滅活苗的免疫效果[J].中國獸醫(yī)雜志,1995,29(2)：6.

[3] 戴鼎震,李 鵬,周長鋒,等.仔豬黃痢K88-K99-987P-F41多價菌毛混合油乳劑滅活疫苗的制備及小鼠免疫保護試驗[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2003,(1)：55.

[4] 孫 宇,沈玉春.仔豬大腸桿菌 K88-ST1-LTB三價基因工程滅活疫苗的應(yīng)用實驗[J].中國獸藥雜志,2002,36(9)：35-36.

[5] 陳 雷,成大榮,徐建生,等.大腸桿菌 F1菌毛表達條件的初探[J].中國獸藥雜志,2000,34(10)：10-13.

[6] 楊正彬、伊學(xué)念.實用免疫學(xué)[M].吉林：長春出版社,1994：403-406.

[7] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)二○○一年版[S].

[8] 巫月生,吳文福,李嘉愛,等.豬大腸桿菌(K88)菌株的生長規(guī)律的探討[J].廣東畜牧獸醫(yī),2001,(5)：29-31.

[9] 王明俊.獸醫(yī)生物制品學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,1996：296.

[10]陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].第三版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2001：27.