納米孔硅灰石載藥抗菌止血材料的研究

陳 于 徐 燦 蘇佳燦 李文銳

(上海市第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院，上海 200433)

納米孔硅灰石載藥抗菌止血材料的研究

陳 于 徐 燦 蘇佳燦＊李文銳

(上海市第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院，上海 200433)

采用溶膠-凝膠法，以聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物(P123)為模板劑，合成了納米孔硅灰石(np-WT)，用np-WT載鹽酸萬古霉素研制了一種新型的載藥抗菌止血材料，并對其止血性能進行了研究。結果表明：np-WT具有排列有序的納米孔道結構，其孔徑在2 nm左右，高比表面積的np-WT能夠明顯地縮短體外部分凝血活酶時間(APTT)和凝血酶原時間(PT)。載藥np-WT能夠在磷酸緩沖溶液(PBS)中緩慢地釋放藥物，載藥np-WT對其凝血性能沒有明顯的影響。載藥np-WT對大腸桿菌有很好的抗菌作用，細胞毒性實驗表明：載藥np-WT無細胞毒性。載藥np-WT具有很好的止血性能，能夠阻止兔背部傷口的流血和縮短其流血時間。

納米孔硅灰石；止血；藥物緩釋；抗菌；生物相容性

因日常交通、自然災害等引起的人體創(chuàng)傷時有發(fā)生，創(chuàng)傷出血是威脅生命的主要原因之一，而有效地止血是創(chuàng)傷急救外科手術中急需解決的問題，能否在事故現(xiàn)場或戰(zhàn)場對創(chuàng)傷進行快速止血，決定了傷員生與死的命運[1-3]。近年來，局部止血材料的研究和應用為其提供了一種新方法，特別是對深、不易暴露的創(chuàng)面和實質臟器損傷創(chuàng)面，應用局部止血材料可以起到較好的止血效果[4-6]。

以往重傷者在包扎后還需服用或注射大量消炎止痛藥，用以緩解傷痛，防止感染；而口服或注射的藥物在多數(shù)情況下只有部分能達到患病部位，大部分則隨血液分散到身體的各部分，可能會造成對正常組織和器官的傷害、引起新的疾病或后遺癥[7-8]。因此，從治療角度來看，有必要開發(fā)載藥型止血材料，使得止血和治療同步進行。

將消炎等相關藥物分散于止血材料內(nèi)，使其直接與病灶接觸，這時藥物可從材料中逐步而穩(wěn)定地釋放出來，對病灶進行較長時間高效地供藥，使材料在止血的同時兼具治療功能[9-10]。這類止血劑的開發(fā)，用藥量會明顯降低，止血和治療效果將明顯提高。因此，本工作將研制一種載藥(鹽酸萬古霉素)抗菌止血材料用于創(chuàng)傷急救。

1 實驗部分

1.1 材料制備與表征

以硅酸鈉和氯化鈣為鈣硅源、聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物(P123)為模板劑、硝酸為催化劑，采用溶膠-凝膠法制備納米孔硅灰石樣品。將20 g的P123溶于300 mL去離子水中，加熱到60℃，用恒溫磁力攪拌器強力攪拌溶液至澄清，加入含50 g硅酸鈉的水溶液，繼續(xù)攪拌約30 min，再加入含52 g氯化鈣的水溶液，用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)反應液體pH值為10左右，繼續(xù)加熱攪拌，反應5 h后形成穩(wěn)定膠體。然后將膠體于室溫陳化3 d，再用烘箱于60℃干燥1～2 d。干燥后的樣品在650℃煅燒6 h(升溫速度1℃·min-1)，得到最終的納米孔硅灰石樣品。采用與上述同樣的方法(但不加模板劑P123)合成了非孔硅灰石作為對照樣品。將納米孔硅灰石用行星球磨機研磨3 min(300 r·min-1)得到均勻的粉末。取少量粉末樣品在無水乙醇中超聲分散，用滴管將含樣品的乙醇液滴到碳支持膜上，常溫干燥后，用透射電鏡觀察材料的微觀結構并拍照。用物理吸附分析儀測定不同相對壓力p/p0下納米孔硅灰石的N2等溫吸附-脫附曲線，通過BET計算，分析材料的比表面積和孔容，根據(jù)Barrett-Joyner-Helen(BJH)公式計算出材料的平均孔徑。

1.2 藥物釋放

研究納米孔硅灰石材料吸附鹽酸萬古霉素(簡稱藥物)后在PBS溶液中的釋放情況。首先測定鹽酸萬古霉素濃度與吸光度的標準曲線；分別取一定量的藥物，用 PBS(pH=7.4)配置成 5、10、20、50、100、200和500 μg·mL-1溶液，分別測定這些溶液的吸光度，繪制標準曲線。在5 g納米孔硅灰石和非孔硅灰石分別滴加1 mL鹽酸萬古霉素水溶液(5 mg·mL-1)，讓材料充分吸附藥物，然后晾干。將吸附了藥物的材料分別放入PBS溶液中，在不同時間點(1、2、3、6、12、24、48、72 h)， 取出一定量的溶液測定其吸光度，再對照藥物濃度吸光度的標準曲線，得出不同時間材料的釋藥量，3個平行樣取平均值，并繪制緩釋曲線。

1.3 抗菌性能

抗菌實驗采用大腸桿菌(E.coli)ATCC 87399為細菌模型。將待測試的樣品先用70%的酒精消毒，然后用電子天平分別稱量0.4 mg納米孔硅灰石(未載藥和載藥)放入 0.04 mL 的細菌溶液中(3.25×104CFU·mL-1)，用聚乙烯板蓋好。在濕度大于90%和37℃溫度下培養(yǎng)24 h。用10 mL含吐溫80的生理鹽水洗滌，取0.2 mL洗液放到含營養(yǎng)成份的瓊脂上，并在濕度大于90%和37℃溫度條件下，分別培養(yǎng)1和12 h，計數(shù)活細菌的數(shù)目，每種樣品做3個平行測試，取平均值。抑菌率可用下式計算：

R(%)=((BC)/B)×100%

其中，R是抗菌率 (%)，B是空白組的平均細菌數(shù)目(CFU/樣品)，C是實驗組的平均細菌數(shù)目(CFU/樣品)。

1.4 細胞毒性

根據(jù)ISO：10993-5細胞毒性測試標準。在37℃下，用無血清細胞培養(yǎng)基分別浸泡納米孔硅灰石材料(未載藥和載藥)24 h(200 mg·mL-1，材料與液體比例)，得到各自的浸提液。以每孔3×103的濃度接種MC3T3-E1細胞到96孔組織培養(yǎng)板，繼續(xù)孵育1 d后，棄去培養(yǎng)基；PBS清洗3遍，分別加入材料的浸提液，繼續(xù)培養(yǎng)1 d；未加材料浸提液的作為空白對照組。達到測試時間點時，每孔加入30 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗3遍，每孔加入100 μL DMSO，室溫靜置10 min后，用酶標儀于490 nm波長處，測溶液的吸光度值。

1.5 止血性能

采用部分凝血活酶時間(APTT)和凝血酶原時間(PT)2個凝血指標來考察材料對凝血系統(tǒng)的影響。SD大鼠血漿的制備方法具體如下：用烏拉坦麻醉(0.4 μL/100 mg體重)SD 大鼠后，從大鼠腹主動脈處抽取血液，并及時加入抗凝劑枸櫞酸鈣(0.109 mol·L-1，1∶9)以防止血液凝結，在 4 ℃、3000 r·min-1條件下，冷凍離心制得貧血小板血漿。

在試管內(nèi)加入貧血小板血漿，再分別加入納米孔硅灰石材料(未載藥與載藥)以及對照樣非孔硅灰石，迅速將二者混合均勻后，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，加入氯化鈣溶液，仔細觀察并記錄出現(xiàn)纖維蛋白絲的時刻，該時間為部分凝血活酶時間。作法同上，按照實驗設計的比例，在試管內(nèi)加入貧血小板血漿和納米孔硅灰石粉末材料，快速加入PT試劑，并置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，迅速搖勻并且記錄凝固所需的時間，該部分時間為凝血酶原時間，未加入材料的空白組作為對照。

1.6 動物止血實驗

皮膚止血實驗：用電子天平稱取棉球、納米孔硅灰石粉末材料(未載藥與載藥材料)和對照樣非孔硅灰石各若干份備用。新西蘭大白兔固定在實驗箱內(nèi)，不麻醉。選擇大白兔背部作為實驗部位，用刀片橫向劃開皮膚，迅速將上述納米孔硅灰石粉末材料撒在傷口上并用棉球輕按一定時間，除去壓力后如果棉球周圍無滲血即為止血，用秒表確定止血時間。

2 結果與討論

2.1 材料的微觀結構分析

圖1a是納米孔硅灰石材料的透射電子顯微鏡照片，顯示的是納米孔硅灰石的微觀結構和形貌。由圖可見，材料具有蜂窩狀的孔道結構特征，孔道排列有序，這正是以P123為模板劑(造孔劑)形成納米孔道的形貌特征，孔道直徑大約在2 nm左右。

圖1b是納米孔硅灰石材料的孔徑與孔容分布圖，結果表明：材料的孔徑分布很集中 (2.0 nm左右)。從BET和BJH計算可以得出：納米孔硅灰石的比表面積為 487 m2·g-1，平均孔徑為 2.3 nm。 而對照樣品非孔硅灰石的的比表面積為91 m2·g-1，大大低于納米孔硅灰石的比表面積。多孔材料的孔徑大小與致孔劑的種類密切相關，用P123為模板劑合成的納米孔材料的孔徑在2～3 nm之間[11-12]。

圖1 納米孔硅灰石的TEM微觀結構和形貌(a)和納米孔徑(b)Fig.1 Morphology/microstructure of TEM image and pore diameter of np-WT

2.2 藥物緩釋

圖2比較了載藥納米孔硅灰石和非孔硅灰石在PBS溶液中對藥物釋放的影響。由圖可見，7 d內(nèi)，載藥納米孔硅灰石與非孔硅灰石在PBS溶液中的藥物緩釋過程有明顯的區(qū)別。當材料裝載(吸附)相同藥量的時候，非孔硅灰石的藥物釋放過程基本集中在前12 h(藥物釋放較快，藥物濃度在短時間內(nèi)局部過高，這對病灶不利)，藥物釋放率超過90%，12 h后，藥物釋放曲線進入平穩(wěn)期，即材料釋放藥物進入溶液中的量很少，不能起到治療作用。而載藥納米孔硅灰石在PBS溶液中的藥物釋放則覆蓋了整個浸泡過程(7 d中，藥物釋放較慢)，這說明納米孔硅灰石具有緩釋藥物的作用。同時也可以看出，納米孔硅灰石在藥物緩釋足夠時間(7 d)后，藥物釋放率也能達到90%。藥物從材料中逐步而穩(wěn)定地釋放出來，對病灶可以有較長時間的高效供藥。

圖2 載藥納米孔硅灰石和非孔硅灰石在PBS溶液中的藥物釋放情況比較Fig.2 Comparison of drug release from np-WT and WT into PBS solutions

2.3 細胞毒性實驗

生物醫(yī)用材料首先要求其對人體無毒害作用，生物安全性好[13]。因此，我們采用細胞模型來測試未載藥和載藥的納米孔硅灰石對MC3T3-E1細胞生長的影響。圖3是材料的細胞毒性測試結果：未載藥和載藥的納米孔硅灰石與空白對照(組織培養(yǎng)板)的吸光度值之間沒有顯著性的差異。這說明隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量不斷增加，未載藥和載藥的納米孔硅灰石對細胞的生長沒有負面影響。結果表明：未載藥和載藥納米孔硅灰石生物相容性好，沒有細胞毒性。

圖3 未載藥和載藥納米孔硅灰石的細胞毒性Fig.3 Cytotoxicity of np-WT and np-WT loaded drug

2.4 抗菌率

圖5是未載藥和載藥的納米孔硅灰石對大腸桿菌殺菌效果圖，圖中的白色顆粒(箭頭)為大腸桿菌菌落。培養(yǎng)12 h后，載藥納米孔硅灰石培養(yǎng)皿中的細菌幾乎不存在，表明載藥納米孔硅灰石有良好的抗菌效果，而未載藥的納米孔硅灰石沒有抗菌作用，培養(yǎng)皿中有大量的細菌菌落。圖5顯示是載藥納米孔硅灰石在不同時間的抗菌率，未載藥材料為對照樣。培養(yǎng)1 h后，載藥納米孔硅灰石抗菌率為91%，12 h后，其抗菌率為100%。表明載藥納米孔硅灰石有很好的抗菌作用，具有長時間的抑菌效果，而未載藥的納米孔硅灰石沒有抗菌作用。

圖4 載藥納米孔硅灰石12 h的抗菌效果(a)，未載藥納米孔硅灰石(b)為對照樣Fig.4 Antibacterial effects of np-WT loaded drug at 12 h(a),and np-WT(b)as a control

圖5 載藥納米孔硅灰石在不同時間的抗菌率，未載藥納米孔硅灰石為對照樣Fig.5 Antibacterial ratio of np-WT loaded drug atdifferent time,np-WT as a control

一般情況下，創(chuàng)傷出血在包扎后還需服用或注射大量消炎藥，以防止感染，而口服或注射的藥物只有部分能達到患病部位，大部分則隨血液分散到身體的各部分，可能會造成對正常組織/器官的傷害。因此，本研究開發(fā)藥物緩釋型止血材料，使材料兼具止血和治療功能。

2.5 體外止血實驗(PT和APTT測試)

圖6 未載藥與載藥納米孔硅灰石的體外止血性能(PT和APTT)，非孔硅灰石為對照樣Fig.6 Comparison of hemostatic properties(PT and APTT)of np-WT and np-WT loaded drug,and WT as a control

圖6顯示的是未載藥與載藥納米孔硅灰石的APTT和PT凝血時間，非孔硅灰石作為對照樣。由圖可見，和對照樣相比，未載藥與載藥納米孔硅灰石的APTT和PT凝血時間明顯減少(縮短)，這是由于納米孔硅灰石具有很高的比表面積和孔容，因而材料具有很強的吸附力，能迅速吸收血液中水分，導致血液濃縮，使血液產(chǎn)生凝結。因而納米孔硅灰石具有很好的凝血性能，而非孔硅灰石的APTT和PT凝血時間明顯延長。另外，未載藥與載藥納米孔硅灰石的APTT和PT凝血時間沒有明顯區(qū)別，這說明載藥對納米孔硅灰石的止血性能沒有影響。

2.6 動物實驗

載藥納米孔硅灰石的體外止血動物實驗見圖7。血液接觸納米孔硅灰石后迅速形成凝塊，這可能是由于納米孔硅灰石迅速吸收血液中水分，相對提高了凝血底物的濃度，從而加快了凝血反應速度。研究表明：納米孔材料可選擇性地吸收血液中的水，導致血液濃縮，激活凝血因子，從而加速凝血，達到快速止血[14-15]。動物實驗結果表明：與正常凝血產(chǎn)生的濕潤柔軟的血凝塊比較，含有納米孔硅灰石的血凝塊干燥、強度更大，因而能耐受出血部位血液較大的壓力，因此可用于外傷止血和手術護理。

圖7 載藥納米孔硅灰石的體外止血動物實驗Fig.7 Animal hemostatic experiment of np-WT loaded drug

有效的止血是外科手術、外傷中急需解決的主要問題。在各種創(chuàng)傷中，大血管出血是傷員死亡的重要原因之一，及時有效地急救止血，能夠為傷員贏得寶貴時間，降低傷員死亡率[16-17]。美軍在二戰(zhàn)和朝鮮戰(zhàn)爭中因早期出血死亡的傷員占死亡傷員的49%，是傷員死亡的第一位原因[18-20]。局部止血材料可以控制創(chuàng)面滲血、保證術野清晰，對減少創(chuàng)傷、提高手術效率、加速患者術后恢復具有重要意義。

圖8是載藥納米孔硅灰石用于阻止傷口流血的動物實驗(兔背部)，非孔孔硅灰石為對照樣。和對照樣相比，未載藥與載藥納米孔硅灰石覆蓋后的傷口的流血時間明顯減少，為70多秒，而用非孔硅灰石覆蓋后的傷口流血時間接近200 s。結果表明：納米孔硅灰石極大地加快了止血過程，未載藥的納米孔硅灰石流血時間最短(71 s)，載藥納米孔硅灰石的流血時間為78 s，未載藥與載藥納米孔硅灰石覆蓋后的傷口的流血時間沒有明顯區(qū)別。載藥納米孔硅灰石比未載藥的納米孔硅灰石流血時間稍長，主要是由于載藥，對納米孔硅灰石的比表面積和孔有影響，藥物占據(jù)了孔，但影響很小。

圖8 傷口流血時間比較(用未載藥與載藥納米孔硅灰石覆蓋傷口后)，非孔硅灰石為對照樣圖8 Comparison of the bleeding time of np-WT and np-WT loaded drug,and WT as a control

傳統(tǒng)的止血方法如加壓、敷料填塞和止血帶等，都是通過壓力止血，止血帶止血還會造成遠端組織缺血和代謝異常導致嚴重的并發(fā)癥[21]。納米孔硅灰石不僅止血迅速，效率高，操作簡便，而且不像止血帶那樣以阻斷遠斷組織的血流為代價，可保證遠端肢體有血供。因此納米孔硅灰石非常適合用于戰(zhàn)傷急救和平時的創(chuàng)傷快速止血。

3 結 論

采用溶膠-凝膠法，合成了納米孔硅灰石(np-WT)載藥抗菌止血材料，該材料由于存在可控的納米孔道結構(孔徑在2 nm左右)，具有巨大的比表面積和孔容，因而具有超常的吸附能力。納米孔硅灰石可選擇性地吸收血液中的水，導致血液濃縮，激活凝血因子，從而加速凝血，達到快速止血。載鹽酸萬古霉素的np-WT能夠在磷酸緩沖溶液(PBS)中緩慢地釋放藥物，載藥np-WT對其凝血性能沒有明顯影響。載藥np-WT對大腸桿菌有很好的抗菌作用，細胞毒性實驗顯示載藥np-WT生物相容性好，無細胞毒性。納米孔硅灰石能有效地促進血液凝結，使血液PT和APTT的凝血時間明顯地減少(縮短)。動物實驗結果說明納米孔硅灰石材料具有非常優(yōu)良的止血性能，能夠縮短兔背部傷口的流血時間。載藥納米孔硅灰石材料兼具止血和治療雙重功能，在臨床應用上將具有很好的前景。

[1]Farstvedt E,Stashak T S,Othic A.Clinic.Technol.Equine Pract.,2004,3:164-172

[2]YU Mei-Li(于美麗),DU Zhi(杜智).Beijing Biomed.Eng.(Beijing Shengwu Yixue Gongcheng),2008,27(2):208-211

[3]YU Xue-Song(余雪松),HUANG Chi-Bing(黃赤兵),ZHANG Yin-Pu(張銀甫).J.Clinic.Rehabil.Tissue Eng.Res.(Zhongguo Zhuzhi Gongcheng Yanjiu Yu Linchuang Kangfu),2008,12(32):6270-6274

[4]LIU Su(劉宿),NIU Jin-Zhu(牛金柱),GE Heng-Jiang(葛衡江),et al.J.Traumat.Surgery(Chuangshang Waike Zazhi),2004,6(1):50-53

[5]LIU Ya-Ping(劉亞平),HOU Chun-Lin(侯春林),GU Qi-Sheng(顧其勝),et al.Chin.J.Reparat.Reconstruct.Surgery(Zhongguo Xiufu Chongjian Waike Zazhi),2007,1(8):829-832

[6]YU Xue-Song(余雪松),HUANG Chi-Bing(黃赤兵),ZHANG Yin-Pu(張銀甫).J.Traumat.Surgery(Chuangshang Waike Zazhi),2008,10(6):565-567

[7]Dealey C.Br.J.Nurs.,1993,2:358-362

[8]Jones V J.Int.Wound J.,2006,3:79-86

[9]ZHANG De-Xing(張德興),HE Zhong-Jie(何忠杰).Chin.J.Crit.Caremed.(Zhongguo Jijiu Yixue),2005,25(5):353-354

[10]Chen Y,Zheng X,Xie Y,et al.J.Mater.Sci.Mater.Med.,2008,19:3603-3609

[11]Wei J,Chen F P,Shin J W,et al.Biomaterials,2009,6:1080-1088

[12]Li X,Zhang L,Dong X,et al.Microporous Mesoporous Mater.,2007,102:151-158

[13]Yim E K,Leong K W.Nanomedicine,2005,1:10-21

[14]Dai C L,Yuan Y,Liu C S,et al.Biomaterials,2009,30:5364-537

[15]Xu C Q,Zeng Y J,Gregersen H.Med.Eng.Phys.,2002,24:587-593

[16]Franoise A,Toshiki T,Walter C et al.Adv.Biomed.Eng.,2008,36:1708-1713

[17]Ferraz N,Carlsson J,Hong J,et al.J.Mater.Sci.Mater.Med.,2008,19:3115-3121

[18]Alam H B,Burris D,Dacorta J A,et al.Mil.Med.,2005,170:63-69

[19]TIAN Hao(田浩),WU Liang-Ping(吳良平),ZHANG Yu-Xin(張玉新).Clinic.J.Med.Officer(Linchuang Junyi Zazhi),2008,36(6):989-991

[20]Ostomel T A,Stoimenov P K,Holden P A,et al.J.Thromb Thrombol.,2006,22:55-67

[21]LUO Xiong-Ming(羅雄明),WANG Jian-Hua(王建華),XU Shi-Rong(徐世榮).Mater.Rev.(Cailiao Daobao),2005,19(6):78-81

Hemostatic Agent of Nano Prorous Wollastonite Loaded Drug with Antibacterial Properties

CHEN Yu XU Can SU Jia-Can＊LI Wen-Rui
(Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)

A nanoprorous wollastonite (np-WT)was fabricated by using amphiphilic pluronic polymer surfactant(P123,EO20PO70EO20)as templates and sol-gel process,and a hemostatic agent of np-WT loaded drug(Vancomycin Hydrochloride)with antibacterial properties was investigated.The results showed that np-WT with large surface area and well ordered pores of around 2 nm could significantly shorten prothrombin time (PT)and the activated partial thromboplastin time (APTT).The np-WT loaded drug had no obvious effects on its hemostatic properties.The np-WT could slowly release drug into phosphate buffered saline(PBS)for 7 d.The np-WT loaded drug without cytotoxicity had good antibacterial properties.The np-WT loaded drug could shorten the bleeding time of rabbit back wound and control hemorrhage,showing good hemostatic properties.

nanoprorous wollastonite;hemostatic agent;drug release;antibacterial;biocompatibility

R318

：A

：1001-4861(2011)04-0625-06

2010-09-06。收修改稿日期：2010-10-24。

上海市科委納米專項(No.0852nm04300)，上海市人事局人才發(fā)展基金(No.2009003)，中國博士后科學基金面上項目(No.20100470756)資助。

＊通訊聯(lián)系人。 E-mail：sujiacan@yahoo.com.cn