光譜法研究高鐵肌紅蛋白活性中心與咪唑的配位反應(yīng)

周華偉 曹洪玉, 唐 乾, 李進京 鄭學仿＊,,

(1大連大學生物工程學院，大連 116622)(2遼寧省生物有機化學重點實驗室，大連 116622)

光譜法研究高鐵肌紅蛋白活性中心與咪唑的配位反應(yīng)

周華偉2曹洪玉1,2唐 乾1,2李進京1鄭學仿＊,1,2

(1大連大學生物工程學院，大連 116622)(2遼寧省生物有機化學重點實驗室，大連 116622)

采用紫外-可見(UV-Vis)、常規(guī)熒光、同步熒光等光譜法研究了高鐵肌紅蛋白(metMb)與咪唑的軸向配位反應(yīng)的光譜性質(zhì)。結(jié)果表明，metMb-咪唑配位體系的形成使得metMb的Soret帶和Q帶均發(fā)生紅移；并對7位和14位2個Trp殘基微環(huán)境極性的影響是不同的；同時還引起metMb活性中心鐵卟啉597 nm處熒光增強，并且體系熒光強度與加入咪唑的濃度成線性關(guān)系，由此計算了不同溫度下反應(yīng)的配位數(shù)、結(jié)合常數(shù)及熱力學參數(shù)；metMb與咪唑配體之間的配位反應(yīng)是按物質(zhì)的量比1∶1進行的；溫度升高不利于配位反應(yīng)的進行；熱力學參數(shù)表明，此配位反應(yīng)是自發(fā)進行的，焓變是整個配位反應(yīng)的主要動力。

高鐵肌紅蛋白；咪唑；配位反應(yīng)；熱力學參數(shù)；熒光光譜

血紅素蛋白與生物活性小分子的配位反應(yīng)廣泛存在于生命體中，例如二價血紅素鐵蛋白可逆的結(jié)合氧氣從而完成貯存[1]和運輸氧氣的功能[2]，二價和三價血紅素鐵蛋白均可以與信使分子NO配位[3-4]進而完成重要的生理功能。因此，血紅素蛋白與生物活性小分子配位反應(yīng)的研究備受關(guān)注[5-7]。但是研究領(lǐng)域大多集中在利用人工合成的金屬卟啉配合物來模擬血紅素蛋白的配位反應(yīng)[8-9]，研究方法則集中在stopped-flow等動力學方法[10]。

肌紅蛋白(Mb)是由一條多肽鏈和一個血紅素輔基構(gòu)成，因其結(jié)構(gòu)簡單研究較成熟，一直被作為血紅素蛋白配體結(jié)合動力學和構(gòu)象改變的模型體系。利用模型蛋白metMb配位中心597 nm處熒光強度變化的方法推算出配位反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)和熱力學參數(shù)尚屬空白。

本文用UV-Vis、普通熒光、同步熒光等光譜，并結(jié)合metMb配位中心597 nm處熒光強度變化研究了metMb與咪唑配位反應(yīng)的光譜性質(zhì)，得到了metMb與咪唑配位反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)和熱力學參數(shù)，研究結(jié)果對從分子水平上認識生物體內(nèi)血紅素蛋白的配位反應(yīng)提供了有用的信息和數(shù)據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

馬心肌紅蛋白樣品(美國Sigma公司)使用時沒有經(jīng)過進一步的提純，UV-Vis吸收光譜特征峰表明其幾乎全部為metMb。將metMb溶解在Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液(0.05 mol·L-1，pH=7.40)中，配制成濃度為10 μmol·L-1的溶液(應(yīng)避光保存并盡快用于實驗)。將咪唑配制成濃度為1.0 mol·L-1的儲備液。實驗用水為去離子水。儀器主要有日本Jasco公司生產(chǎn)的V-560型UV-Vis分光光度計、FP-6500型熒光分光光度計；德國Julabo公司生產(chǎn)的F-12型制冷和加熱循環(huán)器。

1.2 實驗方法

移取 2 mL 濃度為 10 μmol·L-1的 metMb 溶液于1 cm石英比色池中，置于V-560型UV-Vis分光光度計中，用微量進樣器每次加入 2 μL 1.0 mol·L-1的咪唑溶液(累積總體積小于50 μL)，加入后混合均勻，靜置2 min后，測定metMb與咪唑配位反應(yīng)的UV-Vis吸收光譜的變化。按上述相同操作步驟測定熒光光譜及同步熒光光譜的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 UV-Vis吸收光譜分析

圖1A為用1.0 mol·L-1的咪唑滴定濃度為10 μmol·L-1的metMb溶液所形成軸配體系時Soret帶的光譜變化曲線。隨著咪唑濃度的不斷增加，metMb在409 nm處吸光度值不斷減小，表明metMb在逐漸消耗；同時，吸收譜帶向長波長處不斷的移動，并在416 nm處產(chǎn)生1個等吸光點，此時配位體系中metMb和所形成的配合物具有了相同的吸光度值。根據(jù)Gouterman的四軌道模型[11]，metMb分子Soret帶是由 a1u(π)-eg*(π)躍遷產(chǎn)生，歸屬于卟啉 π-π* 躍遷的第2電子激發(fā)態(tài)。當咪唑與metMb分子進行配位反應(yīng)時，由于這些親核性較強的咪唑分子的引入，咪唑分子電荷通過Fe3+轉(zhuǎn)移到卟啉環(huán)上，使得卟啉環(huán)上電子密度增大，a1u(π)軌道能量增加，與eg*(π)間的能量差減小，激發(fā)能降低，從而造成 Soret帶的紅移[8]。

圖1 咪唑?qū)etMb溶液UV-Vis吸收光譜的影響Fig.1 Effects of imidazole on UV-Vis absorbance spectra of metMb

圖1B為metMb-咪唑配位體系形成時Q譜帶的光譜變化曲線。隨著咪唑濃度的不斷增加，Q帶中503 nm處的峰和543 nm附近的肩峰同時紅移28 nm至531 nm和571 nm附近，并在517 nm和597 nm處產(chǎn)生2個清晰的等吸光點，此時進一步證明了配位體系的形成；根據(jù)Gouterman的四軌道模型及Q帶與配體供電子能力的關(guān)系[12]，配體供電子能力增加則Q帶紅移，503 nm峰和543 nm附近的肩峰同時紅移的實驗現(xiàn)象與咪唑的供電子能力強于水的供電子能力是一致的。

2.2 蛋白質(zhì)內(nèi)源芳香氨基酸殘基熒光變化分析

對于肌紅蛋白的同步熒光光譜Δλ=20 nm時僅表現(xiàn)為酪氨酸殘基的熒光，Δλ=60 nm時則顯示色氨酸殘基的熒光[13]。圖2為metMb-咪唑配位體系形成時Δλ=20 nm時酪氨酸殘基的發(fā)射光譜變化曲線。隨著咪唑濃度的不斷增加，311 nm處熒光增強，同時347 nm處出現(xiàn)1個新的熒光峰。根據(jù)圖3中作為空白對照實驗的咪唑同步熒光 (Δλ=20 nm)可知，347 nm處的熒光峰是過量的咪唑形成的。311 nm處熒光增強則是由于配位體系的形成影響了酪氨酸殘基微環(huán)境的極性。

圖2 咪唑?qū)etMb溶液同步熒光光譜(Δλ=20 nm)的影響Fig.2 Effects of imidazole on synchronous fluorescence spectra of metMb(Δλ=20 nm)

圖 4為 metMb-咪唑配位體系形成時 Δλ=60 nm時色氨酸殘基的發(fā)射光譜變化曲線。隨著咪唑濃度的不斷增加，339 nm處的熒光峰和351 nm處的肩峰熒光強度均在增加，并且339 nm處的熒光峰有紅移現(xiàn)象；同時，在369 nm處出現(xiàn)1個新的熒光峰。根據(jù)圖3中作為空白實驗的咪唑同步熒光(Δλ=60 nm)，369 nm處的熒光峰是過量的咪唑形成的。339 nm處的熒光峰強度增加并有紅移現(xiàn)象，表明配位體系的形成造成色氨酸殘基微環(huán)境極性增加[14-15]。造成圖4中351 nm處肩峰越來越明顯的原因有2個，其一是色氨酸殘基微環(huán)境極性增加對色氨酸2個吸收帶[16]影響不同從而使得肩峰越來越顯著，其二是配位體系的形成對metMb中7位Trp和14位Trp殘基微環(huán)境極性的影響不同近而使得肩峰越來越顯著。圖5為1.0 mol·L-1的咪唑滴定濃度為 1.0 μmol·L-1的 Trp 溶液熒光光譜變化曲線，可以看出在逐漸加入咪唑時單獨的一個Trp并沒有出現(xiàn)肩峰和肩峰增強的現(xiàn)象，只是表現(xiàn)出378 nm處咪唑的熒光峰逐漸增強(對照實驗圖2)。因此，可推斷出圖4中351 nm處肩峰越來越明顯的原因是后者。

圖3 緩沖溶液、咪唑的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of buffer and imidazole

圖4 咪唑?qū)etMb溶液同步熒光光譜(Δλ=60 nm)的影響Fig.4 Effects of imidazole on synchronous fluorescence spectra of metMb(Δλ=60 nm)

圖5 咪唑?qū)rp溶液熒光光譜的影響Fig.5 Effects of imidazole on fluorescence spectra of Trp

2.3 配位中心鐵卟啉環(huán)的熒光變化分析

用Soret帶409 nm激發(fā)metMb可發(fā)射597 nm的熒光[17]，這是由 eg*(π)-a2u(π)躍遷產(chǎn)生的。對照實驗表明咪唑在此處沒有熒光峰。為盡量減少光照對鐵卟啉環(huán)熒光性能的影響，只掃描metMb樣品及最后一次加入咪唑的熒光光譜圖，其余則采用熒光定點采集模式測定597 nm處的熒光強度。圖6表明隨著咪唑濃度的增加，597 nm處卟啉環(huán)熒光增強。這是由于當metMb與咪唑分子進行配位反應(yīng)時，使得卟啉環(huán)上電子密度增大，基態(tài)電子數(shù)增加所致。這是咪唑與metMb之間形成軸配體系的證據(jù)之一[12]。此結(jié)論與紫外-可見吸收光譜的結(jié)果一致。

圖6 咪唑?qū)etMb鐵卟啉環(huán)熒光光譜的影響Fig.6 Effects of imidazole on fluorescence spectra of heme of metMb

以鐵卟啉環(huán)597 nm熒光強度為縱坐標，咪唑濃度為橫坐標作圖(圖7)，對實驗數(shù)據(jù)(298 K)線性擬合得到直線方程(相關(guān)系數(shù)R=0.979 06)，說明鐵卟啉環(huán)熒光強度與加入咪唑的濃度成較好的線性關(guān)系。

2.4 咪唑與metMb的結(jié)合常數(shù)及熱力學參數(shù)

設(shè)咪唑分子與metMb配位時有n個相互獨立且等同的結(jié)合位置，則對下述反應(yīng)(其中L代表咪唑)

結(jié)合常數(shù)K為

式中，CLnmetMb為生成物 LnmetMb 的濃度，Cf,L，Cf,metMb分別為咪唑和metMb的游離濃度，Ct,metMb為metMb的總濃度。因鐵卟啉熒光的增強是由于咪唑和metMb配位引起，則有

令ΔF=F-F0

即

式中F0和F分別為未加和加入給定濃度的咪唑時溶液的熒光強度。因為溶液中咪唑的總濃度遠大于反應(yīng)消耗掉的咪唑濃度，所以Cf,L可以用溶液中咪唑的總濃度代替。

由實驗測得不同溫度(298、303、308 K)時體系在597 nm處的熒光數(shù)據(jù)，根據(jù)公式(4)分別以lg[ΔF/(F0－ΔF)]對lgCf,L線性擬合，求得咪唑與metMb配位反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)K和配位數(shù)n(見表1)。

由表1結(jié)果可知，配位數(shù)n≈1，表明咪唑與metMb之間配位反應(yīng)是按物質(zhì)的量比1∶1進行的(見Scheme 1)；線性關(guān)系較好說明熒光增強公式[21]對所研究的metMb配位反應(yīng)體系是適合的。除此之外，K隨著溫度的升高而逐漸減小，說明溫度升高不利于軸配位反應(yīng)的進行。

表1 MetMb與咪唑配位反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)K、結(jié)合位點數(shù)n、線性相關(guān)系數(shù)R和熱力學參數(shù)Table 1 Binding constant K,number of coordination n of coordination reaction between metMband imidazole,correlation coefficient R and the thermodynamic parameters

圖式1 MetMb與咪唑的配位反應(yīng)Scheme 1 Coordination reaction between metMb and imidazole

中stopped-flow動力學方法求出的metMb和配體結(jié)合熱力學數(shù)據(jù)相比較，符號和大小均在文獻范圍內(nèi)[18-20](表1)。配位反應(yīng)的焓變和熵變均為負值，表明焓變是整個配位反應(yīng)的主要動力。

3 結(jié) 論

本文運用光譜法研究了metMb與咪唑配位反應(yīng)的光譜性質(zhì)及反應(yīng)特點。實驗結(jié)果表明，metMb-咪唑配位體系的形成使得metMb的Soret帶和Q帶均發(fā)生紅移；并對7位和14位2個Trp殘基微環(huán)境極性影響不同；另外還造成metMb活性中心鐵卟啉597 nm處熒光增強，并且體系熒光強度與加入咪唑的濃度成線性關(guān)系，由此計算了不同溫度下配位反應(yīng)的配位數(shù)、結(jié)合常數(shù)及熱力學參數(shù)。與動力學方法得到的數(shù)據(jù)相比較，這些數(shù)據(jù)均比較合適。這些實驗結(jié)果和方法有助于研究其他血紅素蛋白配位反應(yīng)的光譜學性質(zhì)和熱力學參數(shù)等。

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Spectral Study on Coordination Reaction between MetMb and Imidazole

ZHOU Hua-Wei2CAO Hong-Yu1,2TANG Qian1,2LI Jin-Jing1ZHENG Xue-Fang＊,1,2
(1College of Bioengineering,Dalian University,Dalian,Liaoning 116622,China)(2Liaoning Key Laboratory of Bio-organic Chemistry,Dalian University,Dalian,Liaoning 116622,China)

The spectroscopic properties of coordination reaction between metMb and imidazole were investigated by means of UV-Vis absorption spectra,fluorescence spectra,and synchronous fluorescence spectra.The experimental results showed that the transitions of Soret and Q band shifted to lower energies due to the formation of metMbimidazole complex;effect of the formation of metMb-imidazole complex on Trps at position 7 and 14 were different;the equation for calculating the binding constant of imidazole to metMb was introduced based on the relationships between the fluorescence enhancement of heme at 597 nm and the concentration of imidazole.According to the fluorescence enhancement equation,the binding constants of the complex at different temperatures and the thermodynamic parameters at corresponding temperatures were obtained.The coordination reaction was carried out in a molar ratio of 1∶1.The association constant would decrease with increasing temperature,which was a disadvantage factor for the reaction.The thermodynamic parameters revealed that the driving force of the coordination reaction was the change of enthalpy.

metmyoglobin;imidazole;coordination reaction;thermodynamic property;fluorescence spectrum

O629.73；Q518.2

：A

：1001-4861(2011)03-0445-06

2010-10-18。收修改稿日期：2010-11-02。

國家自然科學基金(No.20871024)、遼寧省高校創(chuàng)新團隊項目(No.2006T002，2008T005,2009T003)；遼寧省教育廳項目(No.2009A069，2009A071)和大連市科技計劃項目(No.2008E11SF170)資助。

＊通訊聯(lián)系人。 E-mail：dlxfzheng@163.com