配合物[Mn(EDTB)](NO3)2·DMF的合成、晶體結構及多酚氧化酶(PPO)活性的研究

王 莉 魏麗梅 張 勇,2 裴亞梅

(1華中師范大學化學學院，武漢 430079)(2黃石理工學院化學與材料工程學院，黃石 435003)

配合物[Mn(EDTB)](NO3)2·DMF的合成、晶體結構及多酚氧化酶(PPO)活性的研究

王 莉＊,1魏麗梅1張 勇1,2裴亞梅1

(1華中師范大學化學學院，武漢 430079)(2黃石理工學院化學與材料工程學院，黃石 435003)

合成六齒配體 N，N，N′，N′-四(2-苯并咪唑亞甲基)-1，2-乙二胺(EDTB)及單核錳(Ⅱ)配合物[Mn(EDTB)](NO3)2·DMF，并進行了晶體結構和多酚氧化酶(PPO)模擬活性研究。該配合物為正交晶系，P212121空間群，a=1.172 52(6)nm，b=1.320 83(6)nm，c=2.46191(12)nm，V=3.8128(3)nm3，Dc=1.451 g·cm-3，Z=4，F(xiàn)(000)=1732。最終因子 R(I＞2σ(I))：R1=0.0522，wR2=0.1022；R(全部數(shù)據(jù))：R1=0.0652，wR2=0.1075，F(xiàn)lack 指數(shù)為 0.02(15)。結構分析表明，錳(Ⅱ)分別與配體 EDTB 苯并咪唑環(huán)的 4 個氮原子、兩個亞胺基氮原子發(fā)生配位，形成1個變形八面體結構。采用分光光度法研究配合物的多酚氧化酶活性，以鄰苯三酚為底物，表明在0.1～10 μmol·L-1范圍內，隨著配合物濃度逐漸增大，配合物的氧化促進率從 51.5%增至 82.2%。在 30 ℃，pH=7.8～8.2 條件下，配合物的轉化數(shù)由22.93 h-1增加到51.01 h-1，說明配合物的PPO活性隨著pH值的升高而明顯增強。

錳(Ⅱ)配合物；EDTB；晶體結構；PPO活性。

0 引 言

多酚氧化酶(PPO)是一種廣泛分布在微生物，植物和動物體內的氧化還原酶[1]。生物體內PPO酶兒茶酚的活性部位含雙核銅，兩個銅離子被羥基橋連，間距為0.287 nm，每個銅離子另外與3個組氨酸咪唑氮配位，形成四配位的四面體結構[2]。多酚氧化酶與植物的抗病性有關，植物在抵御病原微生物的侵染過程中，病原相關蛋白家族PPO和酚類代謝系統(tǒng)中的一些酶通過催化木質素及醌類化合物的形成，構成保護性屏蔽而使細胞免受病菌的侵害，也可以通過形成醌類物質直接發(fā)揮抗病作用[3]。此外，在工業(yè)和農業(yè)生產中，PPO的作用直接影響食品、飲料的色澤及品質，特別是在制作綠茶、紅茶、烤煙和水果類飲料的過程中更為突出[4-5]。多酚氧化酶一直是研究的熱點，其生化、生理學性質方面已取得了較大的進展。

本文選擇六齒配體 N，N，N′，N′-四(2-苯并咪唑亞甲基)-1，2-乙二胺(C34H32N10，EDTB)為配體，合成錳-EDTB配合物作為PPO的模型配合物。采用X-射線衍射法測定了其晶體結構，并進行了元素分析、紅外光譜、紫外光譜表征。采用分光光度法研究配合物的多酚氧化酶活性，以鄰苯三酚為底物，表明在 0.1～10 μmol·L-1范圍內，隨著配合物濃度逐漸增大，配合物的氧化促進率從51.5增至82.2%.在30 ℃，pH=7.8～8.2 條件下，配合物的轉化數(shù)由 22.93 h-1增加到51.01 h-1，說明配合物的PPO活性隨著pH值的升高而明顯增強。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

試劑均為市售分析純。Perkin-Elmer 2400型元素分析儀；JEAN-Specord 210型紫外可見分光光度計；NEXUS智能型高分辨率傅里葉紅外光譜儀；WS70-1紅外線快速干燥器；Brucker AXS SMART 1000 CCD單晶衍射儀。

1.2 EDTB配體的合成

依據(jù)文獻方法[6-7]，稱取乙二氨四乙酸(EDTA)14.6 g，鄰苯二胺質量 21.7 g(二者物質的量比 1∶4)，然后加入乙二醇溶劑50～60 mL，160℃油浴反應約6 h，直到無水蒸氣放出為止?？s合產物冷卻至120℃倒入燒杯，邊攪拌邊加入200 mL蒸餾水。冷卻至室溫，變粘稠，加入適量無水乙醇，靜置過夜。過濾得到紫紅色粗產品，然后將粗產品用50 mL 95%乙醇重結晶2～3次得到粉紅色固體產物，用少量丙酮洗滌，得到淡粉色固體粉末 21.9 g，產約 75.5%。

1.3 配合物的合成

稱取提純后的 EDTB(0.58 g，1 mmol)粉末溶解于20 mL甲醇與DMF混合液中，然后在60℃攪拌下加入 Mn(NO3)2·4H2O(0.18 g，1 mmol)水溶液，反應2 h，冷卻過濾，得到淡黃色溶液。將溶液靜置于室溫下數(shù)周后析出淺棕色方形單晶。Anal.Calcd.for C37H39MnN13O7(%)：C 53.33，N 21.81，H 4.62；Found(%)：C 53.13，N 21.79，H 4.60。

配合物的紫外-可見吸收光譜顯示在275 nm處有苯并咪唑環(huán)π-π*躍遷。配合物的紅外吸收光譜是以KBr壓片，在3800～3000 cm-1范圍內強而寬的吸收峰帶歸屬為芳環(huán)上νC-H和νN-H；2 920 cm-1附近的峰可歸屬為亞甲基(-CH2-)的振動吸收；1630～1655 cm-1歸屬為 νC=O；1620 及 1 450 cm-1附近兩個吸收峰可以歸屬為苯環(huán)骨架振動吸收峰 (νC=H)；745 cm-1歸屬為芳環(huán)上C-H的面外彎曲振動或NH的非平面振動；在遠紅外270～290 cm-1歸屬為烷氨氮與金屬配位的νM=N特征振動峰。

1.4 晶體結構的測定和結構解析

選擇尺寸大小為 0.30 mm×0.20 mm×0.20 mm 的淺棕色方形單晶，在室溫295(2)K下，置于Brucker AXS SMART 1000 CCD單晶衍射儀上，用石墨單色器單色化的 Mo Kα 輻射(λ=0.71073)和 φ/ω 掃描方式最終的差值傅立葉圖上，共收集到29628個衍射點，獨立衍射點 8316 個，其中 6876 個(I＞2σ(I))衍射點用于結構精修。晶體結構分析采用SHELXL程序完成，氫原子坐標通過理論加氫程序得到。所有氫原子均采用各向同性熱參數(shù)，非氫原子采用各向異性熱參數(shù)。對原子坐標和熱參數(shù)用全矩陣最小二乘法進行了修正，并用PLATON程序繪出化合物的晶體結構圖。配合物[Mn(EDTB)](NO3)2·DMF為正交晶系，P212121空間群，a=1.17252(6)nm，b=1.32083(6)nm，c=2.46191(12)nm，V=3.8128(3)nm3，Dc=1.451 g·cm-3，Z=4，F(xiàn)(000)=1732，F(xiàn)lack 指數(shù)為 0.02(15)。最終殘差因子 R1=0.0522，wR2=0.1022。最終的差值傅立葉圖上，最高電子密度峰為452 e·nm-3，最低電子密度峰為 -277 e·nm-3。晶體學數(shù)據(jù)和精修參數(shù)見表1，鍵長和鍵角見表2，氫鍵數(shù)據(jù)見表3。

CCDC：771022。

表1 配合物的晶體學數(shù)據(jù)和精修參數(shù)Table 1 Crystal data and structure refinement for the complex

表2 配合物[Mn(EDTB)](NO3)2·DMF部分的鍵長和鍵角Table 2 Selected bond lengths(nm)and angles(°)of[Mn(EDTB)](NO3)2·DMF

表3 [Mn(EDTB)](NO3)2·DMF的氫鍵數(shù)據(jù)Table 3 Hydrogen bond data for[Mn(EDTB)](NO3)2·DMF

1.5 配合物的PPO活性實驗

分光光度法測定多酚氧化酶的活性，因操作簡易、方便、快速，被廣泛采用。PPO活性的測定可采用多種底物，主要有鄰苯二酚、鄰苯三酚、酪氨酸、氯原酸、多巴及多巴胺[8]。通過對比和篩選，本實驗采用鄰苯三酚為測試底物，實驗結果較為敏感和穩(wěn)定。

在 pH=8.2，Tris-HCl 5.0 mL 的緩沖液中分別加入雙蒸水 4.7，4.5，4.3，3.9，3.7，3.2 mL 和模型配合物(30 μmol·L-1)0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5 mL，搖勻后在30℃水浴中恒溫10 min，立即加入30℃恒溫的鄰苯三酚 0.3 mL，4.0 mmol·L-1并混勻，迅速轉入1 cm石英比色皿中，1 min后開始測定，并每隔30 s分別記錄體系在320 nm處的吸光度，共測定9～11個點。

在 5.0 mL，0.1 mol·L-1Tris-HCl的緩沖液 (pH=7.8，8.0，8.2)中分別加入 4.5 mL 雙蒸水和 0.2 mL 模型配合物(濃度為 30 μmol·L-1)，搖勻后在 30 ℃水浴中恒溫10 min，立即加入30℃恒溫的鄰苯三酚0.30 mL(濃度為 4.0 mmol·L-1)混勻，迅速轉入 1 cm石英比色皿中，立即開始測定，每隔30 s分別記錄體系在320 nm處的吸光度，共測定9～11個點，然后每隔1 min測定1次，直到吸光度不再發(fā)生變化，并記錄最大值。

2 結果與討論

2.1 配合物的晶體結構

配合物中錳(Ⅱ)分別與來自EDTB分子的4個苯并咪唑氮原子(N(3)，N(5)，N(2)，N(9))和 EDTB 分子的2個亞胺基氮原子(N(1)，N(7))配位，形成1個六配位的扭曲八面體結構、DMF游離在外界。Mn2+離子周圍的配位環(huán)境上 N(2)，N(3)，N(5)，N(9)處于赤道位置，而N(1)，N(7)處于軸向位置。標題配合物晶體的主要鍵長和鍵角列于表2，標題化合物的不對稱單元橢球圖見圖1。從表2可知，亞胺基氮原子與 Mn2+之間的距離(Mn(1)-N(1)0.237 8(2)nm，Mn(1)-N(2)0.238 8(2)nm)長于苯并咪唑氮原子與Mn2+離子之間的距離(Mn(1)-N(3)0.216 1(2)nm，Mn(1)-N(5)0.2229(2)nm，Mn(1)-N(7)0.216 1(2)nm，Mn(1)-N(9)0.2228(2)nm)，這與苯并咪唑失去 H+帶負電荷的氮離子給電子的能力比亞胺基氮原子給電子能力強的事實相符合。標題配合物中處于軸向位置的 N(1)與處于赤道位置的 N(3)，N(9)，N(5)，N(2)的鍵角大小分別為∠N(3)-Mn(1)-N(1)=75.71(8)°，∠N(9)-Mn(1)-N(1)=75.51(9)°，∠N(1)-Mn(1)-N(2)=76.68°，∠N(5)-Mn(1)-N(1)=89.61(8)°，前 3 個角偏離90°，而后1個角接近90°。處于軸向位置的N(7)與處于赤道位置的 N(1)，N(2)，N(9)，N(3)的鍵角大小分別為∠N(7)-Mn(1)-N(5)=94.49(9)°，∠N(7)-Mn(1)-N(9)=92.60(9)°，∠N(7)-Mn(1)-N(2)=75.59(9)°，∠N(3)-Mn(1)-N(7)=134.01(9)°，前 2 個角接近 90°，而后 2 個角偏離90°。3對處于對角位置的氮原子鍵角大小為：∠N(7)-Mn(1)-N(1)=149.78(9)°；∠N(3)-Mn(1)-N(2)=148.79(8)°；∠N(9)-Mn(1)-N(5)=160.81(9)°，3 個角均偏離180°。標題配合物中心錳(Ⅱ)離子與與配合物[Mn(EDTB)Cl]Cl·H2O[8]，[Mn(EDTB)(Ac)]Ac·EtOH[9]，[Mn(EDTB)(PhCOO)]ClO4·EtOH·H2O[10]的中心金屬錳(Ⅱ)離子的配位模式不同。這是因為配合物[Mn(EDTB)](NO3)2·DMF中心金屬錳(Ⅱ)離子與來自EDTB分子的4個苯并咪唑氮原子和EDTB分子的2個亞胺基氮原子配位，形成1個六配位的扭曲八面體結構，而其他3個配合物中心金屬錳(Ⅱ)離子只與配體EDTB分子的3個苯并咪唑氮原子和EDTB分子的2個亞胺基氮原子配位，同時與1個小分子配體配位形成六配位或者七配位的結構。另外，標題化合物中心錳離子的幾何構型與近期報道的單晶 [Zn(EDTB)](NO3)2·C2H5OH[11]，[Cu(EDTB)](NO3)2·C2H5OH[12]，[Ni(EDTB)](NO3)2·C2H5OH[13]的中心離子的幾何構型基本一致。標題化合物的單胞堆積結構中含有4個[Mn(EDTB)](NO3)2·DMF結構單元。陰離子與其鄰近的配陽離子的苯并咪唑環(huán)上未與Mn(Ⅱ)配位的亞胺基氮形成氫鍵，與鄰近的配陽離子EDTB的苯環(huán)上碳原子形成氫鍵。溶劑DMF分子也與其鄰近的配陽離子EDTB的亞胺基相連的碳原子形成弱氫鍵。晶胞中的8個陰離子NO3-雖未參與配位，但參與了氫鍵的形成，同時起電荷平衡的作用。配合物具體氫鍵數(shù)據(jù)如表3所示，據(jù)此可知，整個晶體中除了范德華引力外，結構單元內部、結構單元之間還靠氫鍵來維系，分子間以較緊密的堆積方式彼此作用成一個整體。

2.2 配合物的PPO活性研究

在 30 ℃，0.1 mol·L-1的 Tris-HCl(pH=8.2)緩沖液中加入固定量的鄰苯三酚溶液，先測定鄰苯三酚自氧化速度，然后加入一定量的PPO模型配合物，測定鄰苯三酚的自氧化速度。加入鄰苯三酚1 min后開始記錄，并每隔30 s分別記錄體系在320 nm處的吸光度。

配合物-鄰苯三酚反應體系中，自氧化時間t對吸光度A的線性回歸方程：

A為吸光度，t為自氧化時間，K0直線斜率，即鄰苯三酚的自氧化速度，Kt為直線的截距。K0和Kauto分別代表體系中有或無PPO模型化合物時鄰苯三酚的自氧化速率。鄰苯三酚促進率為η，若改變加入PPO的濃度(c)，可計算出不同濃度時的促進率，作出η-c曲線，再計算PC50(促進率為50%的濃度)。PC50越小，表明該PPO模型配合物活性越高[13]。反應體系的吸光度A對自氧化時間t的關系如圖2，R2代表直線的擬合優(yōu)度值。反應體系的回歸參數(shù)及相應的促進率η見表4。從表4可以看出，在30℃，pH=8.2，配合物濃度在 0.1～10 μmol·L-1范圍內，隨著濃度的逐漸增大，配合物催化鄰苯三酚的活性逐漸增大，促進率從51.5%增至72%。當濃度大于2 μmol·L-1時，促進率逐漸趨于穩(wěn)定。經計算，可得該配合物 PC50約為 0.6 μmol·L-1。

圖2 Tris-HCl(pH=8.2)緩沖體系中吸光度隨時間和配合物濃度變化關系Fig.2 Absorbance vs autoxidation time of pyrogallol in Tris-HCl(pH=8.2)buffer at a different concentration of the complex

表4 配合物動力學參數(shù)及促進率ηTable 4 Kinetic data and η of the complex

在 30 ℃，底物鄰苯三酚濃度為 4.0 mmol·L-1，模型配合物濃度為 6 μmol·L-1。采用 Tris-HCl，不同pH值的緩沖溶液中，配合物對鄰苯三酚的催化氧化用動力學公式表述，配合物ln[(Af-Ai)/(Af-At)]～t關系圖見圖3，Af為反應完全時溶液的最終吸光度值，Ai為反應開始時溶液的吸光度值，At為反應中某時刻溶液的吸光度值。ln[(Af-Ai)/(Af-At)]～t關系圖為直線關系，斜率為K說明此配合物的多酚氧化酶活性在上述條件下基本符合動力學一級反應。在pH=7.8～8.2 條件下，配合物的轉化率 K 由 22.93 h-1增加到51.01 h-1(見表5)，說明配合物的PPO活性隨著pH值的升高而明顯增強。綜上可見，標題配合物的PPO模擬活性較高，而其模擬活性機理還有待進一步探討。

圖3 pH對PPO活性的影響Fig.3 Effect of pH on PPO activity

表5 pH條件對配合物的動力學數(shù)據(jù)的作用Table 5 Effect of pH on kinetic data of the complex

致謝：感謝華中師范大學化學院劉長林教授悉心的指導和修改!

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Synthesis and Crystal Structure of Complex[Mn(EDTB)](NO3)2·DMF and Its Polyphenol Oxidase Activity

WANG Li＊,1WEI Li-Mei1ZHANG Yong1,2PEI Ya-Mei1
(1School of Chemistry,Central China Normal University,Wuhan 430079,China)(2School of Chemical and Materials Engineering,Huangshi Institute of Technology,Huangshi,Hubei 435003,China)

The title complex[Mn(EDTB)](NO3)2·DMF[EDTB=N,N,N′,N′-tetrakis-[(2-benzimidazolyl)methyl]-1,2-ethanediamine]has been synthesized and characterized by elemental analysis and single crystal X-ray diffraction method.The crystal of mononuclear Mn(Ⅱ) complex belongs to orthorhombic crystal system with space group,P212121,a=1.172 52(6)nm,b=1.320 83(6)nm,c=2.461 91(12)nm,V=3.812 8(3)nm3,Dc=1.451 Mg·m-3,Z=4,F(000)=1 732.The final R(I＞2σ(I)):R1=0.052 2,wR2=0.102 2 and R(all data):R1=0.065 2,wR2=0.107 5,Flack parameter:0.02(15).The manganese(Ⅱ) atom of the cation has distorted octahedral coordination geometry and is six-coordinated by four nitrogen atoms of the benzimidazole groups and two tertiary amine nitrogen atoms from the ligand.Polyphenol oxidase activity toward pyrogallol has been studied spectroscop ically.In the 0.1 ～10 μmol·L-1rang,promotion rates of the complex increase from 51.5%to 82.2% .The turnover numbers of the complex toward pyrogallol increase from 22.93 h-1to 51.01 h-1at 30 ℃,showing polyphenol oxidase activity of the complex increasing with pH.CCDC:771022.

manganese(Ⅱ)complex;EDTB;crystal structure;polyphenol oxidase activity

O614.7+11

：A

：1001-4861(2011)01-0125-06

2010-06-27。收修改稿日期：2010-10-12。

國家自然科學基金(No.21001047)和深圳微生物基因工程重點實驗室開放基金資助項目。

＊通訊聯(lián)系人。E-mail：wl_928@mail.ccnu.edu.cn；會員登記號：S060015331M。