牡蠣脂質(zhì)的超臨界CO2萃取及氣相色譜-質(zhì)譜分析

佟 蕾, 朱 蓓 薇, 周 大 勇, 秦 磊, 遲 雅 麗

(1.大連工業(yè)大學 海洋食品教育部工程研究中心, 遼寧 大連 116034;2.大連工業(yè)大學 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)貝類專業(yè)分中心, 遼寧 大連 116034)

0 引 言

牡蠣是一種世界性的海產(chǎn)經(jīng)濟貝類。牡蠣的收獲季節(jié)比較集中,生鮮牡蠣易變質(zhì)腐敗,長期保存和遠程運輸都有一定的困難,因此,對牡蠣進行深加工,延長產(chǎn)品的貯藏期,提高產(chǎn)品的附加值,意義重大。目前牡蠣的研究多集中在牡蠣肽[1]、牡蠣牛磺酸[1]、牡蠣糖原[2]及牡蠣調(diào)味料[3]等。研究表明,脂質(zhì)占牡蠣肉干重的6%～14%[4-6],其脂肪酸組成中多不飽和脂肪酸占40%以上[4,7],并以高含量的EPA和DHA為特征[4]。當前,在牡蠣精深加工中主要回收水溶性成分,而對牡蠣脂質(zhì)并沒有進行利用,造成嚴重的資源浪費。因此,建立合適的牡蠣脂質(zhì)回收方法非常必要。關(guān)于采用超臨界CO2萃取法提取牡蠣脂質(zhì)的方法尚未見報道。本文旨在采用超臨界CO2萃取法提取牡蠣脂質(zhì),以期尋找一種制備牡蠣脂質(zhì)的綠色途徑。此外,超臨界CO2萃取脂質(zhì)處理過程不會造成物料中蛋白質(zhì)的變性[8],提取脂質(zhì)后剩余殘渣仍可作為原料制備水溶性深加工產(chǎn)品,以實現(xiàn)資源的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

脂肪酸標準品(37 Component FAME Mix)購于Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純或色譜純。

LG-1.0型真空冷凍干燥機,沈陽新陽速凍設備制造有限公司；HA121-50-01C超臨界萃取裝置,江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；Agilent 6890N GC- 5973 MSD氣質(zhì)聯(lián)用儀,美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理

新鮮大連灣牡蠣(Crassostreatalienwhanensis)于2009年4月購于大連長興水產(chǎn)市場,原料去殼后,洗掉附著的泥沙和鹽分,瀝干水分,冷凍干燥后粉碎至20目,存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 牡蠣凍干粉化學組成分析

水分含量測定：AOAC(1990)標準方法952.08[9]；

粗蛋白含量測定：AOAC(1990)標準方法981.10[9],N×6.25；

總糖含量測定：苯酚硫酸法(以葡萄糖為標準)[10]；

粗脂肪含量測定：索氏提取法[11]。

1.3 牡蠣脂質(zhì)的提取

1.3.1 超臨界CO2萃取法

稱取50 g牡蠣凍干粉末置于超臨界裝置的萃取釜中,升壓升溫后進行萃取,萃取條件參照文獻[12]：萃取壓力28 MPa,萃取溫度50 ℃,CO2體積流量20 L/h,萃取時間80 min。萃取完成后,將所收集脂質(zhì)稱重,存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 不可皂化物(甾醇)的提取

不可皂化物的提取方法參照文獻[13-14]。將100 mg脂質(zhì)樣品置于四氟乙烯墊片旋蓋小瓶中,加入2.5 mL質(zhì)量濃度為0.5 g/mL氫氧化鉀溶液和5 mL 95%的乙醇溶液?；靹蚝髷Q緊瓶蓋,60 ℃水浴加熱2 h,加熱過程中不斷攪動。皂化完成后,在冷水中迅速冷卻至室溫。使用正己烷萃取不可皂化物,每次加入4 mL,萃取6次。將正己烷合并后用去離子水洗至中性,35 ℃下氮吹至恒重,稱重后存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 脂肪酸的提取及甲酯化

脂肪酸的提取及甲酯化方法參照文獻[13-14]。將上述萃取不可皂化物后剩下溶液用6 mol/L鹽酸調(diào)至pH 1.0以下。冷卻至室溫后用正己烷萃取可皂化物,每次加入4 mL,萃取6次。將正己烷合并后用去離子水洗至中性,35 ℃下氮吹至恒重,并稱重。取適量不可皂化物溶于正己烷中,使其質(zhì)量濃度為10 mg/mL。取2 mL不可皂化物溶液置于四氟乙烯墊片旋蓋小瓶中,并向小瓶中加入2 mL新配制的甲基化試劑(含1%硫酸的色譜級甲醇),70 ℃水浴加熱1 h。反應完成后冷卻至室溫,加入1 mL去離子水,取出含有脂肪酸甲酯的正己烷層存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 GC-MS分析

不可皂化物和脂肪酸甲酯均使用Agilent 6890N GC-5973 MSD氣質(zhì)聯(lián)用儀進行分析。色譜柱：HP-5-MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),使用氦氣為載氣,恒壓0.11 MPa(16.09 psi)。脂肪酸甲酯分析條件：初始溫度140 ℃,保持5 min；以2.5 ℃/min速度升至250 ℃,保持10 min；以50 ℃/min的速度升至300 ℃,保持10 min。不可皂化物分析條件：初始溫度200 ℃,保持5 min；以5 ℃/min速度升至320 ℃,保持10 min。質(zhì)譜分析采用EI源(70 eV),選取Scan模式,掃描范圍m/z50～550,溶劑延遲4 min。在脂肪酸的分析中,根據(jù)GC-MS中各組分保留時間以及質(zhì)譜圖,通過脂肪酸標準品(37 Component FAME Mix)和NIST02庫檢索進行鑒定,用峰面積歸一法計算各脂肪酸的組成。在甾醇的分析中,根據(jù)GC-MS各組分的質(zhì)譜圖,通過NIST02庫檢索進行鑒定,用峰面積歸一法計算各甾醇的組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣干粉的主要營養(yǎng)成分

新鮮牡蠣中,貝殼可占總質(zhì)量的80%～85%,貝肉占10%～20%,殼內(nèi)海水占5%～8%[15]。海洋貝類的營養(yǎng)組成受棲居地、食物及采收季節(jié)的影響很大[16]。從表1所測定的牡蠣肉凍干粉的主要營養(yǎng)組成來看,含有36.8%的總糖和47.3%的蛋白質(zhì),脂肪為9.2%,此結(jié)果與課題組之前所測定的一月份采收的同種屬牡蠣的營養(yǎng)組成略有差別[6]。牡蠣干粉中含有9.2%的總脂,表明其可作為提取脂質(zhì)的原料。

表1 牡蠣干粉的營養(yǎng)成分(干重)

Tab.1 Content of nutritive constituents in oyster meat (on dry basis)

成分粗脂肪粗蛋白總糖水分w/%9.247.336.82.4

2.2 超臨界CO2萃取法提取牡蠣脂質(zhì)的回收率

本實驗采用的提油條件是課題組前期研究超臨界CO2萃取法提取扇貝內(nèi)臟脂質(zhì)最優(yōu)條件[12]。采用“1.3.1”所示方法提取牡蠣脂質(zhì)的回收率為68.48%,說明此方法適用于牡蠣脂質(zhì)的提取。

2.3 牡蠣脂質(zhì)的脂肪酸組成

多不飽和脂肪酸是指含有兩個或兩個以上雙鍵的脂肪酸。花生四烯酸、EPA、DHA等都是人體不可缺少而自身又不能合成的必需脂肪酸,在人體內(nèi)具有廣泛的生理功能和生物學效應[17]。牡蠣脂質(zhì)中脂肪酸甲酯的總離子流色譜圖見圖1,牡蠣脂質(zhì)的脂肪酸組成分析結(jié)果見表2。本研究所提取的牡蠣脂質(zhì)中,花生四烯酸(C20:4n-6)、EPA(C20:5n-3)、DHA(C22:6n-3)等多不飽和脂肪酸含量較高,可占總脂肪酸的34.6%,這也與文獻[4-5]報道的結(jié)果相符,說明牡蠣脂質(zhì)具有很高的開發(fā)和利用價值。

圖1 脂肪酸甲酯的總離子流色譜圖

Fig.1 The total ion chromatography of fatty acid methyl esters

2.4 牡蠣脂質(zhì)的甾醇組成

甾醇類(sterols)化合物在自然界中廣泛分布,固態(tài)時又稱固醇,是以環(huán)戊烷全氫菲為骨架(又稱甾核)的一種化合物。牡蠣中甾醇的總離子流色譜圖見圖2,牡蠣脂質(zhì)中甾醇組成分析結(jié)果見表3。由表3可知,經(jīng)超臨界CO2萃取法提取的牡蠣脂質(zhì)的不可皂化物主要由甾醇類化合物組成,其膽甾醇質(zhì)量分數(shù)較高(接近40%),還含有較多的麥角甾醇衍生物、豆甾醇衍生物以及巖藻甾醇。牡蠣甾醇中膽固醇相對含量較低,說明其是一種健康脂質(zhì)。麥角甾醇主要分布在菌類中,豆甾醇主要分布在植物中,而巖藻甾醇主要分布在藻類中,牡蠣脂質(zhì)中含有的這些甾醇可能來源于其攝入的食物。軟體動物一般不能自行合成甾醇,其體內(nèi)的甾醇都是通過食物攝取的[18]。

表2 超臨界CO2萃取牡蠣脂質(zhì)中脂肪酸組成分析

Tab.2 Fatty acids compositions (%) of lipids extracted by SC-CO2method

脂肪酸w/%C14:02.6C16:1n-76.3C16:022.5C17:00.7C18:2n-63.0C18:1n-910.3C18:1n-77.8C18:03.7C20:4n-61.7C20:5n-320.4C20:2n-70.3C20:1n-93.0C20:1n-72.6C22:6n-39.1未鑒定5.9飽和脂肪酸29.4單不飽和脂肪30.1多不飽和脂肪酸34.6

圖2 甾醇的總離子流色譜圖

表3 超臨界CO2萃取牡蠣脂質(zhì)中甾醇組成分析

Tab.3 Sterols compositions (%) of lipids extracted by SC-CO2methods

甾醇w/%(22Z)-26,27-二降-麥角甾-5,22-二烯-3β-醇1.9膽甾-5,22-二烯-3β-醇4.4膽甾醇39.4膽甾烷醇4.9(22E,24S)-麥角甾-5,22-二烯-3β-醇16.1麥角甾-5,24-二烯-3β-醇13.3豆甾醇0.922,23-二氫-豆甾醇12.2豆甾烷醇0.7巖藻甾醇6.4

傳統(tǒng)的提取脂質(zhì)(有機溶劑萃取)過程中,大部分的有機溶劑都可以回收再利用,但是此過程仍然會不可避免的排放少量有機溶劑。與傳統(tǒng)的有機溶劑萃取法相比,超臨界CO2萃取法雖然在提取效率上相對較低,但由于其提取過程不用有機溶劑,可以防止提取產(chǎn)品中對人體有害溶媒的殘留和對環(huán)境的污染。此外,由于超臨界CO2萃取溫度相對較低,不會造成提取原料中的蛋白質(zhì)變性[8],提取的剩余殘渣還可以繼續(xù)加以利用,也值得更進一步的研究。

3 結(jié) 論

(1)采用超臨界CO2萃取法制備牡蠣脂質(zhì),其回收率為68.48%。

(2)超臨界CO2萃取法制備的牡蠣脂質(zhì)的EPA和DHA含量高,分別占總脂肪酸的20.4%和9.1%；膽固醇含量低,占甾醇的39.4%,有一定的開發(fā)利用價值。

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