三七中人參皂苷Rh1的分離與純化

李 龍 華， 富 瑤 瑤， 石 嶺， 許 郁 峰， 魚 紅 閃， 金 鳳 燮

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034;2.大連生生綠谷生物工程有限公司， 遼寧 大連 116023 )

0 引 言

三七 [Panaxnotoginseng(Burk.) F. H. Chen] 為五加科人參屬植物，含有多種化學(xué)成分，其中三七總皂苷為主要有效活性成分之一，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%～12%[1]。三七中含有的人參皂苷Rh1為20(S)-原人參三醇(Protopanaxatriol)型皂苷[2-3]，具有極高的生理活性，在抑制癌細(xì)胞增值，抗腫瘤等方面體現(xiàn)了良好的藥效[4]，因而獲得人參皂苷Rh1單體對深入研究其藥理作用具有重要意義。另外，三七比人參價(jià)格低，從三七中提取獲得稀有人參皂苷Rh1，對人參皂苷Rh1的研究具有重要經(jīng)濟(jì)意義。

劉廷強(qiáng)等[5]研究了三七提取中人參皂苷的轉(zhuǎn)化。目前文獻(xiàn)對于人參皂苷Rh1的制備報(bào)道較少。本研究以藥材三七為原料提取三七總皂苷，運(yùn)用硅膠層析法從三七總皂苷中分離純化人參皂苷Rh1，再經(jīng)高效液相色譜檢測產(chǎn)品純度，為大量制備人參皂苷Rh1提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

人參皂苷Rh1標(biāo)準(zhǔn)品，大連工業(yè)大學(xué)天然活性物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化研究中心提供；三七，購于藥店；薄層層析板Silica Gel 60-F254，德國 Merck 公司產(chǎn)品；大孔吸附樹脂，南開大學(xué)化工廠；硅膠，青島海洋化工廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 三七總皂苷的制備

取1 000 g的藥材三七粉碎，加入7 000 mL 75%乙醇浸泡48 h，浸泡過程中適當(dāng)攪拌，紗布、濾紙過濾后，收集浸出液，濾渣繼續(xù)加入乙醇浸泡。同上法循環(huán)3次，將3次所得濾液合并，濃縮、干燥。將干燥粉末溶于1 000 mL的去離子水中，分別用400、300、300 mL石油醚分3次脫去其中的脂溶性成分，收集水相；然后用800、600、400 mL水飽和正丁醇分3次萃取三七總皂苷，收集正丁醇相，濃縮干燥。將干燥粉末溶于適量的去離子水中，經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂柱反復(fù)吸附，8倍柱體積去離子水脫糖，6倍柱體積70%乙醇洗脫皂苷。收集皂苷洗脫液，采用D296大孔吸附樹脂柱脫色，適量70%乙醇洗脫皂苷，直至TLC檢測不再有皂苷流出，收集洗脫液，濃縮干燥，得三七總皂苷。

1.2.2 硅膠層析分離人參皂苷Rh1

樣品膠的制備：稱取三七總皂苷25 g充分溶解于氯仿-甲醇[V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶1]的混合溶液中，取80～100目的硅膠65 g，緩慢傾倒于皂苷溶液中，于70～80 ℃水浴邊加熱邊攪拌，使硅膠與皂苷溶液均勻混合，待溶劑揮發(fā)完全后即成樣品膠。

裝柱：將400 g 300～400目硅膠作為分離膠均勻裝入柱中，真空泵抽氣，使之均勻細(xì)密。在硅膠上層均勻平鋪4 cm起緩沖作用的80～100目硅膠，最后在頂層加入樣品膠，并在其表面鋪上棉花層。裝柱后，首先用純氯仿通柱，然后用氯仿-甲醇[V(氯仿)∶V(甲醇)=8.5∶1.5]混合液作為流動(dòng)相洗脫，流出液每200 mL收集一次，TLC跟蹤檢測洗脫過程人參皂苷Rh1的流出情況。

1.2.3 薄層層析(TLC)

采用薄層層析法[5]檢測人參皂苷Rh1。微量點(diǎn)樣器吸取人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品及樣品，點(diǎn)樣于薄層層析板上。依照樣品濃度確定點(diǎn)樣量，每次點(diǎn)樣均需風(fēng)干再進(jìn)行下一次點(diǎn)樣。展開劑為氯仿-甲醇[V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶2.5∶0.5]混合液。顯色劑10% H2SO4水溶液，加熱顯色。

1.2.4 高效液相色譜檢測人參皂苷Rh1純度

色譜儀，美國Waters 2695 Separations Module；檢測器，美國Waters 2996 Photodiode Array Detector；色譜柱，C-18 Hypersil ODS2 5 μm (4.6 mm×150 mm)；工作溫度，20 ℃；柱溫，35 ℃；體積流量，1.0 mL/min；樣品進(jìn)樣量，10 μL；檢測波長，203 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 三七總皂苷的提取

按照 “1.2.1”的制備方法，1 000 g藥材三七制得三七根總皂苷粗品225.2 g；經(jīng)提純濃縮后得到三七總皂苷112.2 g；112.2 g三七總皂苷經(jīng)大孔吸附樹脂柱處理，得產(chǎn)品76.2 g，提取率為7.62%。三七總皂苷經(jīng)TLC檢測結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，三七總皂苷中含有一定量的人參皂苷Rh1。

Rb1、Rd、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2和C-K，人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品；1，三七根總皂苷

圖1 三七總皂苷的提取

Fig.1 Extract of total notoginsenoside fromPanaxnotoginseng

2.2 硅膠柱分離人參皂苷Rh1

按照“1.2.2”的方法分離人參皂苷Rh1，收集洗脫液，TLC檢測結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，對照標(biāo)準(zhǔn)品人參皂苷Rh1，三七總皂苷中的人參皂苷Rh1從第6組分開始出現(xiàn)，直至第15組分基本洗脫完全，其中第7、8、9組分為相對較純凈的人參皂苷Rh1。收集第7、8、9 3個(gè)組分的洗脫液，減壓濃縮，蒸干后得人參皂苷Rh1單體0.36 g，得率為1.44%。

2.3 人參皂苷Rh1純度的鑒定

取1 mL人參皂苷Rh1樣品，溶于1 mL色譜甲醇中測定，HPLC結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，三七總皂苷中分離得到的人參皂苷Rh1保留時(shí)間為36.646 min，純度為66.08%，基本達(dá)到分離目的。

Rb1、Rd、Rg1和Rh1，人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品；原，三七根總皂苷；1～20，洗脫組分

圖3 人參皂苷Rh1的純度鑒定

3 結(jié) 論

采用乙醇浸提，石油醚脫脂，水飽和正丁醇萃取，大孔吸附樹脂脫糖脫色對三七總皂苷進(jìn)行制備。1 000 g藥材三七粉碎后，經(jīng)乙醇浸提獲得三七總皂苷粗品225.2 g。經(jīng)石油醚脫脂、水飽和正丁醇萃取后，得三七總皂苷112.2 g。經(jīng)AB-8樹脂柱脫糖，D296樹脂脫色后，得三七總皂苷76.2 g，提取率為7.62%。

采用硅膠層析法精制三七總皂苷中的人參皂苷Rh1。25 g三七根總皂苷以氯仿-甲醇[V(氯仿)∶V(甲醇)=8.5∶1.5]混合液作為流動(dòng)相洗脫，經(jīng)硅膠層析得人參皂苷Rh1單體0.36 g，得率為1.44%，高效液相色譜檢測其純度為66.08%，基本達(dá)到分離目的。

[1] 張喜平,齊麗麗,劉達(dá)人. 三七及其有效成分的藥理作用研究現(xiàn)狀[J]. 醫(yī)學(xué)研究雜志, 2007, 36(4):96-98.

[2] 張均田. 人參冠百草-人參化學(xué)、生物學(xué)活性和藥代動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)展[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2008:34.

[3] YU Hong-shan, ZHANG Chun-zhi, LU Ming-chun, et al. Purification and characterization of new special ginsenosidase hydrolyzing multi-glycisides of protopanaxadiol ginsenosides, ginsenosidase type I[J]. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2007, 55(2):231-235.

[4] 金鳳燮. 天然產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2009:78-79.

[5] 劉廷強(qiáng),何璐璐,魚紅閃,等. 三七提取中人參皂苷的轉(zhuǎn)化[J]. 大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 28(3):111-114.

(LIU Ting-qiang, HE Lu-lu, YU Hong-shan, et al. Transformation of ginsenosides of Panax notoginseng during extraction[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2009, 28(3):111-114.)