外源添加劑水楊酸對菊花江蘺抗寒性的影響

范皖蘇, 黃鶴忠, 徐汗福, 何華敏, 賈一何

（蘇州大學 基礎醫(yī)學與生物科學學院, 蘇州大學 水產(chǎn)研究所, 江蘇 蘇州 215123）

外源添加劑水楊酸對菊花江蘺抗寒性的影響

范皖蘇, 黃鶴忠, 徐汗福, 何華敏, 賈一何

（蘇州大學 基礎醫(yī)學與生物科學學院, 蘇州大學 水產(chǎn)研究所, 江蘇 蘇州 215123）

通過室內實驗生理生態(tài)學的方法研究了外源添加劑水楊酸（SA）對菊花江蘺（Gracilaria lichevoides）抗寒性的影響。研究表明, 通過添加0.5 mmol/L的SA, 可以明顯降低（實驗組）江蘺的丙二醛（MDA）積累量、電解質滲透率; 其脯氨酸含量、特定生長率（RSG）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）的活性均明顯高于未用SA處理組。在低溫（6～8℃）條件下, 0.5 mmol/L SA處理組與未處理組及其他SA處理組相比存活時間明顯延長, 特定生長率（RSG）未出現(xiàn)負增長。表明添加0.5 mmol/L的SA可以明顯提高江蘺耐低溫脅迫能力。

菊花江蘺（Gracilaria lichevoides）; 低溫; 水楊酸; 抗性

菊花江蘺（Gracilaria lichevoides）隸屬于紅藻門、真紅藻綱、杉藻目、江蘺科、江蘺屬, 分布在中國的臺灣省和菲律賓等溫帶和亞熱帶潮間帶或低潮線附近的天然海域, 為中國臺灣、海南和福建等海水池塘或淺海水域的主要栽培種類[1]。菊花江蘺適宜生長的海水溫度為 l5～36℃, 是目前國內外報道的江蘺種類中最耐高溫的大型經(jīng)濟海藻, 它不但是養(yǎng)鮑的主要餌料、瓊膠工業(yè)和保健食品的原料,更重要的是近海和海水養(yǎng)殖池塘春、夏、秋季均可適用的水質環(huán)境修復的工具藻, 已被浙江、江蘇和山東等地少量引進[2]。盡管該藻的營養(yǎng)體在中國福建以南地區(qū)能比較順利地過冬, 但是在浙江及以北的地區(qū)無法安全越冬, 嚴重影響了它在中國沿海大面積推廣的區(qū)域。因此, 解決菊花江蘺的越冬保種問題顯得十分必要。

水楊酸（SA）是普遍存在于高等植物體內的內源生長調節(jié)物質, 已有大量的實驗證實水楊酸可以提高植物對低溫、高溫、鹽害等脅迫的抗性。研究表明, 噴施SA能顯著提高低溫下黃瓜葉片[3]和黃瓜幼苗[4]的抗氧化酶活性, 提高水稻幼苗[5]抗低溫脅迫能力, 降低低溫對細胞膜損害, 提高植株抗氧化酶活性。但是, 有關SA對江蘺等海藻的耐低溫效果研究至今未見報道。作者在實驗室條件下通過生理生態(tài)學方法, 研究提高江蘺抗低溫脅迫能力的SA適宜添加量, 從而為生產(chǎn)上江蘺北移越冬保種提供理論依據(jù)和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料來源與預培養(yǎng)

試驗用菊花江蘺（Gracilaria lichevoides）（本文均簡稱江蘺）采自福建沿海, 經(jīng)空運帶回實驗室后的鮮活藻體除去表面附著雜藻, 用過濾海水沖洗干凈,移植到盛有15 L水體的人工海水f/2培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng), 培養(yǎng)條件為（22±1）℃, 光照強度 80 μmol/（m2·s）, 光周期 12 L : 12 D, 鹽度 23, pH 為 7.8。期間每隔3 d添加N、P營養(yǎng)鹽1次, 每天定時攪水3次,以保持藻體健康和生長。

1.2 實驗設計與方法

根據(jù)預先進行的試驗結果, 將 SA按高（1 mmol/L）、中（0.5 mmol/L）、低（0.25 mmol/L ）和未添加SA共4個濃度處理組分別培養(yǎng)于（25、12、10、8、6 ℃）5個溫度水平中, 其中25℃作為常溫對照, 各低溫組均從25℃開始, 每隔2 d降低5℃, 直至達到各設計溫度后開始實驗。每個SA與溫度梯度設3個平行, 實驗在 500 mL的三角燒瓶中進行, 均采用 f/2培養(yǎng)基, 在光照培養(yǎng)箱內按設定的溫度培養(yǎng), 其他培養(yǎng)條件同擴大培養(yǎng), 培養(yǎng)過程中不充氣, 每日搖動2～3次, 培養(yǎng)時間為10 d。實驗結果采用F值方差分析法進行顯著性差異分析。

1.3 測定指標及其方法

1.3.1 藻體生長的測定

在培養(yǎng)7 d后分別測定各組藻體的質量, 計算藻體的特定生長率（RSG）。藻體的特定生長率（RSG,%/d）=[（Wt/W0）1/t－1] ×100%, 其中:W0為開始時的鮮質量,Wt為t時間的鮮質量,t為實驗天數(shù)。

1.3.2 細胞膜透性測定

采用電導法[6]測定, 用 DDS-320型電導率儀測定江蘺初電導率S初和終電導率S終。計算出相對電導率S相對,S相對=S初/S終, 用于評估細胞膜透性的大小[7]。

1.3.3 丙二醛（MDA）含量的測定

采用硫代巴比妥酸比色法[8]測定丙二醛含量（MDA）, MDA含量（濕質量）的單位以μmol/g計。

1.3.4 脯氨酸含量的測定

采用茚三酮顯色法測定[8]脯氨酸含量, 脯氨酸質量比（濕質量）的單位以μg/g計。

1.3.5 超氧化物酶歧化酶（SOD）活性的測定

采用氮藍四唑（NBT）光化學還原法測定[8]SOD活性, SOD以1 g鮮藻體（濕質量）中抑制NBT光化還原50%的酶量為一個酶活力單位, 用U表示。

1.3.6 過氧化物酶（POD）活性的測定

用愈創(chuàng)木酚法進行測定[8]POD活性, POD的酶活力單位為1 g鮮質量藻體（濕質量）1 min內A470的變化, 用U表示。

1.3.7 過氧化氫酶（CAT）活性的測定

采用比色法[8]測定CAT活性, 取粗酶液0.2 mL,加入3 mL CAT反應混合液, 迅速倒入比色杯中, 紫外分光光度計測量240 nm處吸光度值。每1 min讀數(shù)1次, 共讀2次。以1 min內吸光度值的變化值表示酶活性, 用U表示。

2 結果與分析

2.1 不同溫度條件下的 SA處理對江蘺生長率的影響

圖 1反映了江蘺在低溫脅迫下, 在實驗培養(yǎng)的10 d期間內其特定生長率（RSG）的變化情況。在低溫脅迫下, 各實驗組江蘺RSG均較低, 隨著溫度的下降,江蘺的RSG也呈下降趨勢。特別是在低溫8 ℃時, 未處理實驗組江蘺的RSG出現(xiàn)了負值; 在低溫 6 ℃時,0.25 mmol/L和1 mmol/L SA處理的實驗組也出現(xiàn)負增長; 而0.5 mmol/L SA處理的實驗組在低溫處理下未出現(xiàn)負增長。方差分析表明, 0.5 mmol/L SA處理的實驗組與其他各實驗組及未處理組的RSG水平差異明顯（P＜0.05）。由此可見, 低溫影響了江蘺的生長和物質合成, 更低的溫度還會引起江蘺的負生長甚至死亡, 但添加適宜劑量的SA可顯著改善江蘺在低溫環(huán)境下的生存和生長。

圖1 不同濃度水楊酸和溫度處理對江蘺特定生長率的影響（以下各圖濃度處理及標識均相同）Fig. 1 Effects of different concentrations of SA on special growth rate ofG.lichevoidesto chilling stress （The following chart dealed with the same concentrations）

2.2 不同溫度條件下的 SA處理對江蘺細胞膜透性的影響

圖2 不同濃度水楊酸和溫度處理對江蘺細胞膜透性的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of SA on electrolytes leakage ofG.lichevoidesto chilling stress

圖 2顯示, 不同濃度 SA以及不同的低溫處理,江蘺細胞膜電解質滲透率不同, 隨著溫度的下降,江蘺電解質滲透率也逐漸增高。未添加SA處理的實驗組在低溫 12、10、8、6℃下, 相對電導率分別為33.31 %、35.78 %、40.11 %、42.55 %; 而添加0.5 mmol/L SA的實驗組的相對電導率依次分別為24.25 %、29.37%、33.86 %、35.31 %, 與相同低溫梯度下0.25、1 mmol/L和未添加SA的實驗組相比, 相對電導率較低, 且差異明顯（P＜0.05）。在25℃常溫下,隨著SA處理濃度的提高, 江蘺細胞的相對電導率呈上升趨勢, 但差異不顯著（P＞0.05）。由以上結果可以看出, 在低溫條件下, SA對細胞質膜具有良好的保護作用, 其中0.5 mmol/L 的SA處理效果較好。

2.3 不同溫度條件下的 SA處理對江蘺MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物, 是植物器官衰老或在逆境條件下發(fā)生膜脂過氧化的產(chǎn)物之一, 其含量高低表示細胞膜脂過氧化程度和植物對逆境條件耐受的強弱[9], 其含量的變化是質膜損傷程度的重要標志之一。從圖3中可以看出, 在低溫處理下未經(jīng) SA處理的實驗組植物體內 MDA含量上升很快,而經(jīng)SA處理實驗組的MDA含量上升緩慢, 且MDA的含量低于未處理組水平。方差分析表明, 在低溫條件下, 經(jīng)過0.5 mmol/L SA處理的實驗組的MDA含量顯著低于其他各組的水平（P＜0.05）。

圖3 不同濃度水楊酸和溫度處理對江蘺MDA含量的影響Fig. 3 Effects of different concentrations of SA on MDA content ofG.lichevoidesto chilling stress

2.4 不同溫度條件下的 SA處理對江蘺脯氨酸含量的影響

目前大多數(shù)研究認為脯氨酸與植物抵御溫度逆境存在相關性, 因此, 脯氨酸含量可以作為植物抗逆性的一個檢測指標[10]。從圖4可以看出, 在低溫脅迫過程中, 江蘺體內的脯氨酸含量均比常溫條件下有顯著提高（P＜0.05）, 而且, SA處理的實驗組脯氨酸含量明顯高于未處理實驗組含量, 其中, 用 0.5 mmol/L SA處理的實驗組脯氨酸含量上升最快, 在同一低溫（12、10、8、6℃）條件下與未處理組相比其含量分別高出 43.3%、50.5%、40.4%、51.1 %（P＜0.05）。實驗表明, 低溫脅迫能誘導江蘺體內產(chǎn)生一定量的脯氨酸用以抵抗逆境, 而在添加SA的情況下, 可能促進藻體攝取合成蛋白的主要營養(yǎng)元素, 從而加強脯氨酸的合成, 導致藻體內脯氨酸含量增高[11]。

圖4 不同濃度水楊酸和溫度處理對江蘺脯氨酸含量的影響Fig. 4 Effects of different concentrations of SA on proline content ofG.lichevoidesto chilling stress

2.5 不同溫度條件下的 SA處理對江蘺SOD活性的影響

圖 5 不同濃度水楊酸和溫度處理對江蘺 SOD活性的影響Fig. 5 Effects of different concentrations of SA on SOD activity ofG.lichevoidesto chilling stress

SOD可以催化超氧陰離子自由基的歧化作用成為分子氧或過氧化氫, 控制脂質氧化, 減少超氧陰離子對植物體膜系統(tǒng)的傷害。由圖5可以看出, 與常溫（25℃）處理相比, 低溫（12、10、8℃）條件下各實驗組SOD活性均呈上升趨勢, 可能是低溫刺激了植物體內超氧陰離子的大量產(chǎn)生, 進而誘導了江蘺體內SOD活性的提高。實驗表明, 0.5 mmol/L SA處理組的SOD活性水平顯著高于其他各低溫實驗組的水平（P＜0.05）。在6℃低溫條件下, 各濃度組的SOD活性均較低, 與 25 ℃處理組的 SOD 活性相近, 而 0.5 mmol/L SA處理組的SOD活性仍顯著高于其他各處理組和未處理組（P＜0.05）。由此可見, 添加 0.5 mmol/L SA可有助于提高江蘺在低溫脅迫下其體內SOD活性。

2.6 不同溫度條件下的 SA處理對江蘺POD活性的影響

研究表明, 低溫脅迫下, 植物體內會產(chǎn)生大量的H2O2, H2O2可以間接地氧化細胞內核酸、蛋白質等生物大分子, 并使細胞膜受到損害, 從而加速細胞的衰老和解體[8], 而POD是植物體內清除H2O2的活性酶。由圖 6可見, 與常溫（25℃）處理相比, 低溫下各實驗組POD活性均呈上升趨勢, 顯示低溫脅迫刺激了江蘺體內POD的活性; 且0.5 mmol/L SA處理組的POD活性水平均分別顯著高于其他各實驗組在低溫下的水平（P＜0.05）。在 6℃低溫條件下, 各濃度組的POD活性均較低, 與25 ℃處理組的POD活性相近, 顯示隨著低溫脅迫的加劇, POD酶合成受到影響; 而0.5 mmol/L SA處理組的POD活性仍顯著高于未處理組（P＜0.05）。

圖6 不同濃度水楊酸和溫度處理對江蘺POD活性的影響Fig. 6 Effects of different concentrations of SA on POD activity ofG.lichevoidesto chilling stress

2.7 不同溫度條件下的 SA處理對江蘺CAT活性的影響

CAT是植物體內清除H2O2的活性酶。由圖7可見, 與常溫（25℃）處理相比, 低溫（12、10、8℃）下各實驗組 CAT活性均呈上升趨勢, 顯示低溫脅迫刺激了江蘺體內CAT的活性。且0.5 mmol/L SA處理組的 CAT活性顯著高于其他各實驗組（P＜0.05）。由結果顯示, 0.5 mmol/L SA處理實驗組在低溫（12、10、8℃）條件下的 CAT活性分別達到 370.43、407.82、347.89 U/（g·min）, 其含量與未處理組、0.25 mmol/L和1.0 mmol/L SA實驗組相比, 分別提高了34.21%、29.78%、25.67%, 33.62%、22.95%、18.75%和 31.80%、25.49%、19.58%。在低溫6℃條件下, 各處理組CAT活性均出現(xiàn)了下降, 且與25 ℃處理組的CAT活性相近, 但0.5 mmol/L SA處理組的CAT含量仍然明顯高于未處理組的含量（P＜0.05）。

圖7 不同濃度水楊酸和溫度處理對江蘺CAT活性的影響Fig. 7 Effects of different concentrations of SA on CAT activity ofG.lichevoidesunder chilling stress

3 討論

3.1 SA與膜系統(tǒng)和膜脂過氧化的關系

植物受到低溫傷害時, 細胞質膜透性會有不同程度增大, 電解質會不同程度地外滲, 從而導致電導率提高。抗寒性較強的植株, 細胞膜透性隨著低溫脅迫的加劇而增大的程度較小; 反之, 抗寒性較弱植株, 細胞膜透性會大大增加[12-13]。因此, 細胞質膜相對透性常用作植物抗寒性生理指標之一。本實驗表明, 經(jīng)SA處理后, 江蘺細胞電解質滲透率明顯下降, 說明SA對江蘺細胞膜有保護作用。MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物, 是植物器官衰老或在逆境條件下發(fā)生膜脂過氧化的產(chǎn)物之一, 其含量高低表示細胞膜脂過氧化程度和植物對逆境條件耐受的強弱[9]。本實驗中, SA處理的低溫實驗組 MDA含量顯著低于與未處理組。說明SA處理能使江蘺細胞受傷害程度降低, 提高了江蘺的抗寒性。

3.2 SA與江蘺植株生長和脯氨酸含量的關系

溫度是植物生長發(fā)育所必需的環(huán)境因子之一,它影響植物生長發(fā)育的所有過程。低溫影響了植物進行光合作用等生理反應的各種酶的合成, 不利于植物的生長。本實驗中,RSG雖然隨著溫度的降低而減小, 但是, SA處理組的RSG明顯高于未處理組。脯氨酸作為重要的滲透調節(jié)物質, 在正常情況下, 它在植物體內的含量并不高, 但當植物受到逆境時,它的含量往往會增加[14]。Pang等[15]也報道, 脯氨酸的積累對細胞進行滲透調節(jié)、穩(wěn)定細胞結構、降低氧化起著重要作用。實驗表明, 在不加SA的情況下,江蘺受低溫（6℃）脅迫時, 其藻體內脯氨酸含量與常溫（25℃）時相比沒有升高, 但經(jīng)過適宜濃度 SA處理后, 江蘺植株體內脯氨酸的含量有顯著提高, 從而有利于植物的生長。

3.3 SA與抗氧化保護酶的關系

植物通過體內保護酶系統(tǒng)清除或減少逆境脅迫所產(chǎn)生的活性氧, 避免其對組織細胞的傷害, 從而表現(xiàn)出對氧化脅迫的抗性。SOD可清除超氧陰離子,生成H2O2[17], CAT和POD共同作用清除H2O2, 生成沒有毒害的H2O[18]。保護酶系的SOD、POD和CAT可協(xié)同作用, 清除膜脂過氧化產(chǎn)生的中間產(chǎn)物（自由基）[16]。所以, 增加SOD、POD和CAT的總體活性, 均可降低自由基含量, 減少細胞膜損傷[18]。本實驗結果顯示, 在低溫（12、10、8、6℃）脅迫下, 經(jīng)過 SA 處理的實驗組SOD、POD和CAT含量呈上升趨勢, 且在0.5 mmol/L SA的處理下, SOD、POD和CAT活性最高; 同時, MDA和相對電導率與其他處理組相比其數(shù)值最低。說明, SA對江蘺具有加強保護酶系功能和減少細胞膜損傷的作用。

3.4 SA在江蘺越冬保種中的應用前景

溫度是植物生長發(fā)育所必需的環(huán)境因子之一,它影響植物生長發(fā)育的所有過程。0 ℃以上的低溫對植物造成的傷害, 叫冷害。冷害本質上是低溫對植物體造成的生理損傷, 引起冷害的溫度一般在0～10 ℃或15 ℃, 冷害對植物體的損傷程度除取決于低溫外,還取決于低溫維持的時間長短。使植物發(fā)生冷害的0℃以上的低溫稱為冷脅迫[7]。冷害是世界性的一大難題, 是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中非常嚴重的自然災害, 每年都造成巨大損失。菊花江蘺是生活在溫帶和亞熱帶潮間帶或低潮線附近的天然海域的大型藻類, 因為溫度的原因, 在中國浙江、江蘇、山東等海域還無法安全越冬。SA是一種常見的植物激素, 其用途廣泛,與其他植物激素在抗逆性方面相比有著性價比較高的優(yōu)勢。本實驗條件下, 0.5 mmol/L SA的添加量很少, 但對增強藻體抗低溫脅迫的效果顯著。因此, 如果再輔于適當?shù)谋卦O施可以將本技術應用于生產(chǎn)實際,從而使該優(yōu)良藻種在浙、蘇、魯?shù)群Ｓ蛑许樌^冬。

[1] 何京．江蘺的人工栽培技術[J]．齊魯漁業(yè) , 2004,21（4）: 13-14．

[2] 劉思儉, 揭振英, 曾淑芳．中國江蘺的商品生產(chǎn)及其與對蝦混養(yǎng)[J]．湛江海洋大學學報, 1997, 17（2）:27-30．

[3] 李兆亮, 原永兵, 劉成連, 等．水楊酸對黃瓜葉片抗氧化劑酶系的調節(jié)作用[J]．植物學報, 1998, 40:256-261．

[4] 孫艷, 崔鴻文, 胡榮．水楊酸對黃瓜幼苗壯苗的形成及抗低溫脅迫能力的生理效應[J]．西北植物學報,2000, 20 （4）: 616-620．

[5] 張蕊, 呂俊, 米青山, 等．低溫下外源水楊酸對水稻幼苗抗氧化酶系的影響[J]．西南農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版）, 2006, 28（2）: 29-34．

[6] 劉萍編．植物生理學實驗技術[M]．北京: 科學出版社, 2007: 92-93．

[7] 張蕊．低溫下外源水楊酸對水稻幼苗生理生化特性的影響研究[D]．重慶: 西南大學, 2006．

[8] 鄒崎．植物生理學實驗指導[M]．北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2000: 56-59．

[9] 劉娥娥, 宗會, 郭振飛．干旱、鹽和低溫脅迫對水稻幼苗脯氨酸含量的影響[J]．熱帶亞熱帶植物學報,2000, 8（3）: 235-238．

[10] 耿廣東, 程智慧, 李建設, 等．水楊酸對茄子幼苗抗寒性的影響[J]．西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版）,2002, 31（3）: 101-103．

[11] 彭永康, 郝泗城, 王振英．低溫處理對豇豆幼苗生長的POD、COD、ATPase 同工酶的影響[J]．1994, 9（2）:76-80．

[12] 聶慶娟, 孟朝, 梁海永．低溫脅迫對4 種常綠闊葉植物膜脂過氧化及保護酶活性的影響[J]．植物研究,2007, 27（5）: 578-581．

[13] 曾乃燕, 何軍賢, 趙文．低溫脅迫期間水稻光合膜色素與蛋白水平的變化[J]．西北植物學報, 2000, 20（1）:8-14．

[14] Schat H, SharmaS S, Vooijs R．Heavy metal–induced accumulation of free praline in a metal-tolerant and a nontolerant ecotype of Silene vulgaris[J]．Physiol Plant,1997, 101: 477-482.

[15] Bassi R Sharma SS．Proline accumulation in wheat seeding exposed to zinc and copper[J]. Phytochemistry, 1993, 33: 1339-1342．

[16] 段詠新, 李松泉, 傅家瑞, 等．鈣對延緩雜交水稻葉片衰老的作用機理[J]．雜交水稻, 1997, 12（6）: 23-25．

[17] 童富淡, 胡家如, 陳進紅, 等．不同秧苗方式對早稻葉片 SOD 活性、電解質滲透率和發(fā)根力的影響[J]．浙江農(nóng)業(yè)大學學報, 1997, 23（6）: 682-686．

[18] 潘瑞熾, 豆志杰, 葉慶生, 等．茉莉酸甲脂對水分脅迫下花生幼苗 SOD活性和膜脂過氧化作用的影響[J ]．植物生理學報, 1995, 21（3）: 221-228．

Received: Jun., 23, 2009

Key words:Gracilaria lichevoides; low temperature; salicylic acid; resistance to chilling injury

Abstract:The effect of salicylic acid on the resistance ofGracilaria lichevoidesto chilling injury was studied through in vitro physiological experiments. It was found that 0.5 mmol/L SA could reduce the content of MDA （a product of membrane lipid peroxidation） and relative conductivity and enhance the proline content, special growth rate and the activities of SOD, POD, and CAT, significantly. At 6～8℃, the treatment group （0.5 mmol/L SA） could survived longer than the untreated group, and the special growth rate was positive. So, 0.5 mmol/L SA can enhance the chilling resistance ofG. lichevoides.

（本文編輯:梁德海）

Effects of exogenous salicylic acid on the resistance of Gracilaria lichevoides to chilling injury

FAN Wan-su, HUANG He-zhong, XU Han-fu, HE Hua-min, JIA Yi-he
（School of Medicine and Life Sciences, Medical College of Soochow University, Fisheries Research Institute of Soochow University, Suzhou 215123, China）

S963

A

1000-3096（2011）02-0038-06

2009-06-23;

2010-01-22

江蘇省社會發(fā)展資助項目（BS2002016）

范皖蘇（1985-）, 女, 安徽合肥人, 碩士研究生, 主要從事水生生物生理生態(tài)學研究, E-mail: fanwansu@163.com; 黃鶴忠, 通信作者,副教授, 碩士生導師, 電話: 0512-62276802, E-mail: suda-shui@163.com