過瘤胃保護(hù)煙酸的研制與穩(wěn)定性研究

張立可 王 翀 王迪銘 朱海燕 劉建新 陳 強(qiáng)

煙酸是反芻動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的一種必需維生素，是重要輔酶NAD和NADP的直接前體，參與脂肪酸、碳水化合物和氨基酸的合成和分解。一般認(rèn)為，反芻動(dòng)物瘤胃微生物可以合成足夠量的煙酸來滿足機(jī)體代謝和生產(chǎn)需要。但近來有報(bào)道，隨著飼養(yǎng)條件及環(huán)境因素的變化，反芻動(dòng)物需要補(bǔ)飼煙酸[1]。研究表明，煙酸對(duì)反芻動(dòng)物的脂肪代謝[2]及酮病防治[3]、瘤胃發(fā)酵[4]、生產(chǎn)性能[5]等方面有改善作用。然而未包被煙酸在瘤胃中極不穩(wěn)定，Santsch[6]報(bào)道指出，煙酸在十二指腸前消失率為98.5%。有研究表明，脂類表面被材是一種pH值敏感的物質(zhì)，可在pH值接近中性的環(huán)境下不被降解，但在真胃內(nèi)酸性條件下釋放，故已有報(bào)道可用于小分子物質(zhì)的過瘤胃保護(hù)被材，且保護(hù)效果較好[7]。

本文擬通過使用不同被材，不同的壓力及煙酸含量生產(chǎn)得到過瘤胃保護(hù)煙酸產(chǎn)品。采用體外法評(píng)定包被煙酸的瘤胃消失率和瘤胃后釋放情況，探索不同條件組合對(duì)過瘤胃包被煙酸保護(hù)效果的影響，并通過篩選獲得高過瘤胃保護(hù)效果的煙酸產(chǎn)品，以期用于奶牛生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

以芯材（煙酸）含量、被材以及進(jìn)料速度為變量，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)9種包被煙酸樣品，具體設(shè)計(jì)見表1。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2 包被煙酸的保護(hù)率測定

精確稱取5 g包被煙酸于帶塞錐形瓶中，加入100 ml水，加塞，放入37℃、50 r/min的水浴搖床中，分別于2、4、8、12 h取出，過濾得煙酸濾渣。

殘?jiān)s0.04～0.3 g）經(jīng)冷蒸餾水反復(fù)沖洗，無混濁后，采用復(fù)合預(yù)混料中煙酸、葉酸的高效液相色譜法（GB/T 17813—1999）測定其中的煙酸殘余量。操作方法簡要描述如下：將殘?jiān)糜?0 ml棕色容量瓶中，加 1 ml碳酸鈉溶液（0.1 mol/l），浸濕試樣，加 7 ml提取劑混勻，于超聲波水浴上震蕩提取15 min，用提取劑定容至10 ml，混合均勻，3 000 r/min離心15 min，棄去上層凝固狀油脂，與離心管中遮光4℃保存。測定時(shí)經(jīng)0.45 μm濾膜過濾至帶蓋小瓶中，保證該試液的濃度≤5 μg/ml，4℃冷藏供高效液相色譜法測定煙酸濃度。

計(jì)算得到各包被煙酸的溶出率，并將不溶出率作為保護(hù)率。根據(jù)保護(hù)率結(jié)果，初篩得到4種保護(hù)煙酸，用于后續(xù)瘤胃消失率、瘤胃后釋放率等測定，以得到最佳包被組合。

1.3 體外法瘤胃消失率測定

1.3.1 試驗(yàn)動(dòng)物

浙江大學(xué)試驗(yàn)?zāi)翀鲲曫B(yǎng)的3只體重相近、裝有永久性瘤胃瘺管的湖羊，湖羊日糧為：混合精料180 g/d，苜蓿干草420 g/d。分早晚兩次飼喂，自由飲水。

1.3.2 尼龍袋

取孔徑為300目尼龍布，制成5 cm×5 cm的尼龍袋。尼龍袋采用滌綸線進(jìn)行雙道縫合，邊緣用烙鐵熨燙，使其無散邊，密封。試驗(yàn)前將尼龍袋用蒸餾水洗凈，65℃烘干，檢查無破損方可使用。

1.3.3 制備緩沖液與瘤胃液

緩沖混合液的制備：緩沖混合液的pH值是7.1±0.15[8]。400 ml蒸餾水＋0.1 ml微量元素溶液＋200 ml緩沖液＋200 ml常量元素溶液＋1.0 ml刃天青溶液，用CO2氣體飽和并升溫至39℃后，加40 ml還原劑溶液，繼續(xù)通入CO2，直至溶液由淡藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色。其中還原劑溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)：1 mol/l NaOH 溶液 2 ml、Na2S·7H2O 285mg、蒸餾水 47.5 ml；常量元素液(pH 值 6.8)：Na2HPO49.45 g、KH2PO46.20g、MgSO4·7H2O0.60g，加水至1000ml；緩沖液(pH 值 8.1)：NaHCO335.00 g、NH4HCO34.00 g。加水至1000ml；微量元素溶液：CaCl2·2H2O13.2g、MnCl2·4H2O 10.00 g、CoCl2·6H2O 1.00 g、FeCl2·6H2O 8.0 g，加水至100 ml；刃天青溶液：100 mg刃天青溶于100 ml蒸餾水。

上午08:00從3頭瘺管羊的瘤胃瘺管中用真空泵抽取瘤胃液各200 ml，倒入保溫錐形瓶中混勻，迅速攪拌用4層紗布過濾，將濾液加入到盛有緩沖液的燒瓶中。瘤胃液和緩沖液的混合液pH值為6.90±0.1，緩沖液與瘤胃液的比例為2：1。

1.3.4 體外模擬瘤胃消化

通過40目篩孔粉碎的玉米與羊草以1：1比例混合，每支玻璃注射器(Model Fortuna，Haberle Labortechnik，Lonsee-Ettlenscheiβ，Germany)中加入 200 mg(DM)該日糧。準(zhǔn)確稱取0.5 g四種過瘤胃煙酸初篩產(chǎn)品于尼龍袋中，并用橡皮筋扎緊袋口。共設(shè)置 2、4、6、8、12、24 h六個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)重復(fù)。注射器于39℃的恒溫水浴搖床上預(yù)熱12 h，將30 ml的瘤胃液與緩沖液混合液抽入每個(gè)注射器，隨機(jī)置于恒溫（39℃）水浴搖床內(nèi)培養(yǎng)。，設(shè)置好搖床頻率。分別于2、4、6、8、12、24 h取出試樣尼龍袋，傾去上清液，剩余物用冷蒸餾水沖洗至澄清，39℃烘干（48 h），取出煙酸殘?jiān)?，測定煙酸殘余量[預(yù)混料中煙酸的測定——HPLC法(GB/T 17813—1999)，同 1.2 節(jié)]。

1.4 體外法測定瘤胃后釋放率

根據(jù)反芻動(dòng)物消化生理特點(diǎn)，采用三級(jí)離體消化酶法評(píng)定[9]。

稱取約0.75 g包被煙酸產(chǎn)品于尼龍袋中并裝入玻璃瓶中，4種包被產(chǎn)品每種5個(gè)，共20個(gè)進(jìn)行體外模擬瘤胃消化（同1.3.5）。16 h后取出所有尼龍袋，用冷蒸餾水沖洗至澄清，39℃烘干（48 h）。從每個(gè)袋子中準(zhǔn)確稱取3份80 mg煙酸殘?jiān)?，放?0 ml試管中。加入2 ml含有1 g/l胃蛋白酶的0.1 mg/l鹽酸中加塞培養(yǎng)1 h。接下來0.1 ml濃度為1 mg/l的NaOH溶液被加入體系中用以中和pH值，同時(shí)加入2.7 ml pH值為7.8的胰酶磷酸緩沖液，加塞，并將所有溶液在38℃下恒溫培養(yǎng)。每種樣品于加入NaOH溶液后0、4、8、12、24 h各取出3管（即3個(gè)重復(fù)），過濾并將剩余物沖洗干凈，烘干后采用預(yù)混料中煙酸的測定——HPLC法[GB/T 17813—1999]（同1.2節(jié)）測定剩余物中煙酸含量，并計(jì)算得到煙酸瘤胃后釋放率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Sharma等[10]報(bào)道的擬合公式,計(jì)算煙酸的有效降解率。

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 6.12中ANOVA進(jìn)行方差分析，用Duncan's法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 包被煙酸的溶出率及保護(hù)率

包被煙酸的溶出率和保護(hù)率見表2、表3，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表4、表5。由表4可看出，當(dāng)煙酸含量從45%下降到35%，包被煙酸8h保護(hù)率從73.5%上升到83.6%，但各組間差異不顯著（P＞0.05）；當(dāng)壓力從11 kPa下降到7 kPa，煙酸8 h保護(hù)率分別為77.6%（11 kPa）、80.3%（9 kPa）、79.7%（7 kPa），但是各組之間差異不顯著（P＞0.05）。從被材類型看，固體棕櫚油脂（樹脂1#）保護(hù)率達(dá)89.0%，而單硬脂酸甘油酯（樹脂2#）被材保護(hù)率為72.4%，兩種被材1：1混合作為被材時(shí)的保護(hù)率為76.2%，固體棕櫚油脂（樹脂1#）保護(hù)率顯著優(yōu)于其他組合（P＜0.05）。比較各組極差值大小，可見包被煙酸的被材對(duì)保護(hù)效果影響最大，因子主次順序?yàn)榘徊牧希緹熕岷浚緣毫Γㄒ姳?、表5）。以單位質(zhì)量下4、8、12 h包被煙酸的溶出率為標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)號(hào)為1、2、3、9的4種產(chǎn)品具有較高的保護(hù)率，用于后續(xù)試驗(yàn)。

表2 包被煙酸的溶出率

表3 包被煙酸的4 h和8 h保護(hù)率

表4 4 h與8 h保護(hù)率各因素效應(yīng)分析

表5 8 h包被煙酸的保護(hù)率方差分析

2.2 包被煙酸的瘤胃降解率

未包被煙酸和包被煙酸產(chǎn)品的24 h瘤胃降解曲線見圖1。未包被煙酸在2 h內(nèi)100%消失，4種包被產(chǎn)品在模擬瘤胃內(nèi)消化2 h后，除樣品9外，其余3種樣品降解率也都超過了70%。隨時(shí)間的推移，煙酸降解率升高，24 h后1、2兩個(gè)樣品殘?jiān)鼉?nèi)無法檢驗(yàn)到煙酸，3、9兩種樣品的降解率分別為80.7%和90.6%，均顯著低于未包被或1、2兩個(gè)樣品的消失率100%（P＜0.05）。

包被煙酸的有效降解率及其參數(shù)列于表6。設(shè)定當(dāng) k=0.03 時(shí)，有效降解率為樣品 1=2＞9＞3（P＜0.05）；當(dāng) k=0.05 時(shí)，有效降解率為 1＞2＞9＞3（P＜0.05），即樣品3的瘤胃有效降解率在4種樣品中最低，保護(hù)效果最好。

表6 包被GABA的瘤胃降解參數(shù)與有效降解率

2.3 包被煙酸在瘤胃后的釋放率

表7 包被煙酸的真胃釋放率(%)

各包被煙酸的真胃釋放率列于表7，經(jīng)瘤胃降解后的殘?jiān)牧鑫负筢尫怕柿杏趫D2。包被煙酸在接受胃蛋白酶處理時(shí)并未有明顯的釋放，在胰酶處理下開始釋放并隨時(shí)間的推移不斷增加。1、2兩個(gè)樣品的真胃釋放情況較差，樣品9的瘤胃保護(hù)效果優(yōu)于樣品1、2，但是未能在瘤胃后形成可有效釋放，可能發(fā)生了過度保護(hù)。3號(hào)樣品的釋放率在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都高于其他樣品，在24 h可達(dá)到包被純煙酸的16.2%，說明其瘤胃后的釋放率最佳。

綜合上述分別測定的降解率和釋放率，可以得到樣品號(hào)為1、2、3和9的過瘤胃包被煙酸的總可利用率分別為3.31%、3.62%、16.2%、1.04%，以煙酸含量為35%，用固體棕櫚油脂作被材，壓力為7 kPa條件下生產(chǎn)的產(chǎn)品過瘤胃效果最佳。

3 討論

近年來，應(yīng)用于小分子物質(zhì)的過瘤胃包被技術(shù)正在成為反芻動(dòng)物營養(yǎng)研究的熱點(diǎn)。其主要對(duì)象為氨基酸及其類似物[11]、維生素[12]及膽堿[13]、淀粉[14]和葡萄糖[5]。

本研究綜合包被和微膠囊技術(shù)，采用載體膨化-成分吸附-外包膜的工藝流程生產(chǎn)過瘤胃保護(hù)煙酸，發(fā)現(xiàn)固體棕櫚油脂的保護(hù)效率顯著高于單硬脂酸甘油酯，該結(jié)果與采用相同工藝的過瘤胃γ-氨基丁酸（GBGA）[7]所報(bào)道的結(jié)果相一致。在瘤胃消失率、過瘤胃釋放率等數(shù)據(jù)上，兩者結(jié)果有較大差別。當(dāng)k=0.05時(shí)，本試驗(yàn)最佳包被效果的3號(hào)產(chǎn)品（35%煙酸，單硬脂酸甘油酯，7 kPa）有效降解率也達(dá)到了67.5%，而其最佳包被的3號(hào)產(chǎn)品（50%GBGA，單硬脂酸甘油酯，11 kPa）有效降解率僅為15.9%。同樣，其3號(hào)包被GBGA產(chǎn)品的總消化率達(dá)到了75.8%，而本試驗(yàn)中過瘤胃保護(hù)煙酸經(jīng)16 h體外瘤胃消化后，24 h真胃模擬可利用率最高僅為16.2%。

造成上述差異的原因，可歸納為以下幾種可能：①包被內(nèi)容物本身的不同，本試驗(yàn)中2 h煙酸完全消失，但報(bào)道指出GBGA仍有部分剩余；②內(nèi)容物含量不同，以及不同內(nèi)容物與包被材料、壓力之間的綜合反應(yīng)和鏈接的緊密程度；③體外法與體內(nèi)法的差異，以及每個(gè)尼龍袋所含樣品的質(zhì)量差異(4 g包被GBGA vs.0.2 g過瘤胃保護(hù)煙酸)；④半體外法模擬真胃前，瘤胃消化的不同，本試驗(yàn)采用體外法，采用了16 h的體外模擬消化，而報(bào)道中則采用了24 h的體內(nèi)瘤胃消化。

另外，張力莉等(2004)[9]報(bào)道，以乙基纖維素為壁材包被的過瘤胃保護(hù)性VA微膠囊在精粗比分別為20：80和55：45的日糧條件下24 h瘤胃中的降解率分別為9.94%和25.33%；在真胃中的釋放率接近60%。但由于其包被材料及工藝流程與本試驗(yàn)相差較大，且被材也不一樣，故結(jié)果可比性較差，但可提供一個(gè)改良包被水平的思路。

4 結(jié)論

用固體棕櫚油脂被材或混合被材包被煙酸可在一定程度上免受瘤胃的降解作用，同時(shí)產(chǎn)品又能在瘤胃后有效釋放。用固體棕櫚油脂作為單一被材的保護(hù)效果優(yōu)于混合被材。綜合考慮瘤胃消失率和真胃釋放情況，當(dāng)煙酸含量為35%，用固體棕櫚油脂作為被材，壓力為7 kPa條件下生產(chǎn)的包被煙酸過瘤胃效果較好。

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