糖尿病大鼠腎臟PEDF表達(dá)的變化及絲膠的保護(hù)作用

宋成軍，楊振軍，陳志宏

(承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北承德 067000)

研究認(rèn)為，糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)的發(fā)生是以高血糖或血脂代謝紊亂為啟動因素，誘導(dǎo)各種血管活性物質(zhì)、生長因子、細(xì)胞介質(zhì)、化學(xué)趨化因子、酶和蛋白質(zhì)等多種因素綜合作用所致，引發(fā)腎臟發(fā)生一系列病理變化，包括腎臟肥大、腎小球基底膜和腎小管基底膜增厚，以及腎小球系膜區(qū)ECM進(jìn)行性積聚，進(jìn)而導(dǎo)致腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化，并出現(xiàn)蛋白尿、腎功能衰竭等[1-2]。本研究通過觀察絲膠對DN大鼠腎臟色素上皮衍生因子(pigment epthelium-derived factor,PEDF)表達(dá)的變化，探討絲膠保護(hù)糖尿病(diabetes mellitus,DM)腎臟損傷的作用，為臨床治療DN提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組 清潔級雄性SD大鼠48只，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(合格證號:712024)。大鼠隨機(jī)分為4組:正常對照組、模型組、絲膠治療組和絲膠預(yù)防組，每組12只。模型組、絲膠治療組和絲膠預(yù)防組大鼠均采用2% STZ(25mg/kg,3d)連續(xù)腹腔注射的方法建立糖尿病大鼠模型，以血糖≥16.7mmol/L作為成模標(biāo)準(zhǔn)。待模型成功建立后，模型組大鼠不再作任何處理;絲膠治療組大鼠給予絲膠(2.4g/kg/d)灌胃，連續(xù)35天;絲膠預(yù)防組大鼠于注射STZ前給予同等劑量絲膠灌胃35天。

1.2 藥物與試劑 STZ購于美國Sigma公司，臨用時(shí)用pH4.4的枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液配成2%的溶液。絲膠由彩色蠶繭經(jīng)浸泡、水煎、過濾、濃縮而成，彩色蠶繭由承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所提供。血糖檢測試劑盒，保定長城臨床試劑有限公司;兔抗PEDF抗體，武漢博士德生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白定量試劑盒，北京泰格美科技有限公司。

1.3 檢測血糖 各組大鼠禁食12h以上，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)內(nèi)眥于眶后靜脈叢采血，3000r/min離心20min，收集血清，采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖。

1.4 腎臟PEDF蛋白表達(dá)的檢測 各組大鼠取血后斷頭處死，迅速取雙側(cè)腎臟，一側(cè)腎臟入液氮保存，用于Western Blotting檢測;另一側(cè)腎臟入Bounins液固定，用于免疫組化檢測。

1.4.1 免疫組化染色及定量分析:入Bounins液固定腎臟，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5μm。采用SP免疫組織化學(xué)染色法觀察腎臟PEDF蛋白的表達(dá)。一抗為兔抗，稀釋濃度為1:50，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。以PBS代替一抗作為陰性對照，以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)對免疫組化染色陽性結(jié)果進(jìn)行定量分析:PEDF陽性切片在10×40倍顯微鏡下選取視野，計(jì)算陽性產(chǎn)物面積占整個(gè)視野面積的百分比。每只動物任選3張切片，每張切片選取3個(gè)視野，取平均值。

1.4.2 Western Blotting檢測及定量分析:取200mg腎臟組織，提取蛋白，以BCA蛋白試劑盒定量蛋白濃度。采用Western Blotting法檢測大鼠腎臟PEDF蛋白的表達(dá)，蛋白上樣量為60μg。12% SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜;一抗稀釋濃度為1:200，4℃過夜;Super ECL Plus超敏發(fā)光液顯影。采用Quantiy One軟件對顯影條帶進(jìn)行分析，以PEDF條帶與β-actin條帶的灰度比值作為PEDF蛋白的相對表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖 與正常對照組比較，模型組大鼠的血糖明顯升高(P＜0.01)。絲膠治療組、絲膠預(yù)防組大鼠的血糖明顯低于模型組(P＜0.01)。見附表。

2.2 各組大鼠腎臟PEDF蛋白的表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果:PEDF免疫陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒狀，位于腎小管上皮細(xì)胞胞漿;Western Blotting結(jié)果:在蛋白Marker的50KD水平處，可見PEDF蛋白條帶;在蛋白Marker的43KD水平處，可見β-actin條帶。與正常對照組大鼠相比，模型大鼠腎臟PEDF蛋白的表達(dá)明顯下降(P＜0.01);絲膠治療組、絲膠預(yù)防組大鼠腎臟PEDF蛋白的表達(dá)明顯高于模型大鼠(P＜0.01)。見附表。

附表 各組大鼠血糖和腎臟PEDF蛋白的表達(dá)(±s)

附表 各組大鼠血糖和腎臟PEDF蛋白的表達(dá)(±s)

與正常對照組比較:*P＜0.01，與模型組比較:#P＜0.01

組別 血糖(mmol/L) 腎臟PEDF蛋白表達(dá)免疫組化法 Western Blotting法正常對照組 10.83±2.03 0.0193±0.0042 0.4013±0.050模型組 29.45±4.82* 0.0114±0.0025* 0.3385±0.014*絲膠治療組 13.20±4.09＃ 0.0155±0.0023＃ 0.3915±0.058＃絲膠預(yù)防組 11.04±2.29＃ 0.0163±0.0030＃ 0.3942±0.058＃

3 討論

DN是DM常見的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥，是引起慢性腎功能不全進(jìn)而導(dǎo)致透析治療或腎臟移植的重要病因之一。DN在DM人群中的發(fā)生率為20-40%，伴有終末期DN的患者5年生存率小于20%[3]。目前治療DM多采用一些化學(xué)合成的藥物，如二甲雙胍、西他列汀、拜糖平等，雖然療效可靠但副作用較大。即使是公認(rèn)的經(jīng)典首選藥物—雙胍類，在降低血糖的同時(shí)，易引起乳酸性酸中毒，死亡率較高[4]。正是這些毒副作用促使我們尋找一種降糖療效可靠且毒副作用無或極少的治療DM的新藥物，因此我們選擇了絲膠。

起源于我國的蠶絲業(yè)擁有幾千年的悠久歷史，但對蠶絲的應(yīng)用主要集中于絲素方面，絲膠約占繭絲的30%，在繅絲和精練時(shí)極大部分作為廢料而遭到遺棄[5]。絲膠是蠶絲中包被在絲素外圍的高分子水溶性蛋白，除含少量蠟質(zhì)、碳水化合物、色素和無機(jī)成分外，主要成分為絲膠蛋白;絲膠蛋白由18種氨基酸組成，含有較多的絲氨酸、天門冬氨酸和甘氨酸，其中7%左右是人體的必需氨基酸[6-7]。民間有蠶繭泡水降血糖的驗(yàn)方，本課題組的前期研究亦證實(shí)了這一點(diǎn)[8]。

PEDF屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑(SER-PIN)基因家族，廣泛分布于全身許多組織器官，在腎臟主要分布于腎小管上皮細(xì)胞和腎小管間質(zhì)，只有少量分布于腎小球[9]。PEDF在DN的發(fā)病中是一種保護(hù)性因素，它可抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移，降低腎小球毛細(xì)血管通透性，減少蛋白尿的排出，但PEDF抑制新生血管形成的機(jī)制目前尚不十分明確[10-11]。Stellmach等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，人血管內(nèi)皮細(xì)胞易受微環(huán)境的影響，培養(yǎng)液中內(nèi)皮細(xì)胞凋亡數(shù)目隨PEDF劑量的增加而增加;因此推測，PEDF可能通過促進(jìn)活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、使血管內(nèi)皮細(xì)胞對缺氧誘發(fā)的新生血管形成的信號無反應(yīng)來抑制新生血管形成。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠腎臟PEDF的表達(dá)明顯下降，加上對VEGF的抑制作用減弱，使腎小球毛細(xì)血管通透性增加及新生血管生成，從而導(dǎo)致蛋白尿及腎臟細(xì)胞外基質(zhì)沉積，造成腎臟損害。

本研究發(fā)現(xiàn)，絲膠治療組、絲膠預(yù)防組大鼠腎臟PEDF蛋白的表達(dá)明顯高于糖尿病模型組大鼠。表明，絲膠可通過上調(diào)腎臟PEDF蛋白的表達(dá)，降低腎小球毛細(xì)血管的通透性及減輕細(xì)胞外基質(zhì)沉積，發(fā)揮保護(hù)糖尿病腎臟損傷的作用;同時(shí)，絲膠預(yù)處理可以阻止糖尿病腎臟損傷的發(fā)生，具有良好的預(yù)防保護(hù)作用。

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