結(jié)締組織生長(zhǎng)因子和金屬蛋白酶組織抑制因子-1 RNA干擾靶位的篩選*

蔣玉鳳 黃 飛 張建軍 劉加群 孫華麗

肝纖維化是多種原因引起的慢性肝損傷所共有的病理學(xué)改變，是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成增多、降解不足而在肝內(nèi)過(guò)量沉積的結(jié)果[1]。TGF-β及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑在肝纖維化發(fā)生機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，TGF-β信號(hào)誘導(dǎo)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF） 的表達(dá)而促進(jìn)ECM的合成，誘導(dǎo)金屬蛋白酶組織抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）表達(dá)，阻斷基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）對(duì) ECM 的降解[2～4]。RNA 干擾是目前最有效的基因沉默技術(shù)，能特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而下調(diào)相應(yīng)蛋白水平及功能。RNAi靶序列的選擇很關(guān)鍵,所以，RNA干擾實(shí)驗(yàn)通常需要針對(duì)一個(gè)基因設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），以找到最有效的 siRNA 序列[5，6]。本研究旨在針對(duì)CTGF和TIMP-1目的基因分別設(shè)計(jì)3條siRNA，通過(guò)轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）以篩選有效的抑制序列，為進(jìn)一步研究CTGF和TIMP-1在肝纖維化發(fā)生中的作用以及探索肝纖維化的基因治療奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、細(xì)胞與試劑 大鼠HSC-T6由我院中心實(shí)驗(yàn)室凍存；新生小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；RNA抽提試劑TRIZOL購(gòu)自上海生工公司；CTGF、TIMP-1RNA干擾序列由上海生工公司合成；CTGF、TIMP-1、GAPDH、I型前膠原（Procol-α1）、無(wú)關(guān)序列（silence）引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自FINNZYMES公司；轉(zhuǎn)染試劑KeyGenTransIII購(gòu)自凱基生物科技發(fā)展公司；III型前膠原、粘連蛋白、透明質(zhì)酸放射免疫分析試劑盒購(gòu)自上海海研醫(yī)學(xué)生物技術(shù)有限公司；TGF-β1購(gòu)自美國(guó)Cytokines公司。

二、大鼠CTGF和TIMP-1基因干擾靶位設(shè)計(jì) 在NCBI Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中，在線查詢大鼠CTGF和TIMP-1基因序列。CTGF基因序列的Accession number為 AF120275；TIMP-1基因序列的Accession number為NM-053819。然后，在晶賽公司網(wǎng)站在線設(shè)計(jì)RNA干擾靶位，通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件，各選取3段，同時(shí)設(shè)計(jì)陽(yáng)性對(duì)照（GAPDH/r基因干擾靶位）和陰性對(duì)照（無(wú)關(guān)干擾序列），見表1。

表1 基因靶序列

三、PCR引物的設(shè)計(jì) ①大鼠CTGF（預(yù)計(jì)產(chǎn)物483bp）：上游引物：5’-GCCTCGCCTTGGTGCTCCTCCTCT-3’；下游引物：5’-TGCGGTCCTTGGGCTCATCACAC-3’；②大鼠 TIMP-1（預(yù)計(jì)產(chǎn)物 308bp）：上游引物：5’-GCGCCCTTTGCATCTCTGG-3’，下游引物：5’-TCGCTGCGGTTCTGGGACTT-3’；③大鼠看家基因GAPDH（預(yù)計(jì)產(chǎn)物 570bp）：上游引物：5’-CATAGACAAGATGGTGAAGG-3’，下游引物：5’-TCCACAGTCTTCTGAGTGGC-3’；④大鼠 Procol-α1（預(yù)計(jì)產(chǎn)物409bp）：上游引物：5’-AGCCCCTCAACCCCCAGCCTACTT-3’，下游引物：5’-CCCACCCCACCCCTTCACAGAGAT-3’。

四、dsRNA轉(zhuǎn)染TGF-β1活化的HSC 分組轉(zhuǎn)染已經(jīng)TGF-β1刺激活化的HSC：每組5μg dsRNA分別與490μl無(wú)血清無(wú)抗生素的低糖DMEM培養(yǎng)液混勻后，再加入10μl轉(zhuǎn)染試劑KeyGenTrans III，最終獲得500μl的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2孵育、轉(zhuǎn)染細(xì)胞 48h。分組：CTGF-1、CTGF-2、CTGF-3、TIMP-1-1、TIMP-1-2、TIMP-1-3、CTGF-1/TIMP-1-1、CTGF-1/TIMP-1-2、CTGF-1/TIMP-1-3、CTGF-2/TIMP-1-1、CTGF-2/TIMP-1-2、CTGF-2/TIMP-1-3、CTGF-3/TIMP-1-1、CTGF-3/TIMP-1-2、CTGF-3/TIMP-1-3、陰性對(duì)照組（no-sense）和空白對(duì)照組（不加dsRNA）。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取均值。

五、HSC總RNA的抽提與逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 分別進(jìn)行細(xì)胞裂解和RNA的分離、沉淀、洗脫、再溶解，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

六、目的基因相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè) 采用熒光定量 PCR法，反應(yīng)體系如下：DyNAmo YBRGreenMastermi×25μl，上下游引物各 2μl，cDNA 5μl，滅菌水 16μl，總體積 50μl。各反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀（iCycler，BIO-RAD），按以下條件擴(kuò)增：94℃，5min→（94℃，30s→60℃，30s→72℃，45s）×40個(gè)循環(huán)→72℃，10min。在PCR循環(huán)第2步72℃時(shí)收集熒光信號(hào)，由計(jì)算機(jī)軟件自動(dòng)分析、計(jì)算出Ct值。采用比較閾值法[7]計(jì)算待測(cè)目的基因的相對(duì)表達(dá)量，設(shè)陰性對(duì)照目的基因的表達(dá)量為1，則所得比值為實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于陰性對(duì)照組基因表達(dá)量的倍數(shù)。然后，按照下列公式計(jì)算抑制率。

七、肝纖維化指標(biāo)檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染48小時(shí)后HSC培養(yǎng)上清液，檢測(cè)III型前膠原（procollagen type-III，PCIII）、透明質(zhì)酸（hexadecenoic acid，HA）、粘連蛋白（laminin，LN）含量，使用智能放免測(cè)量?jī)x（SN-695B）完成定量分析。

結(jié)果

一、RNA干擾對(duì)靶基因及其下游產(chǎn)物Procolα1mRNA表達(dá)的影響 見表2。

表2 各干擾組對(duì)靶基因和procol-α1mRNA表達(dá)的抑制作用

二、肝纖維化指標(biāo)的變化 見表3。

表3 各干擾組PCIII、HA和LN水平（ng/ml）的變化

討論

TGF-β及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在肝纖維化發(fā)生機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[8～10]。CTGF 和 TIMP-1 是 TGF-β 信號(hào)通路之下游分子，前者促進(jìn)ECM合成，后者抑制ECM降解，在肝纖維化發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮協(xié)同促進(jìn)作用。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诓捎冕槍?duì)介導(dǎo)HSC活化的關(guān)鍵因子CTGF和TIMP-1的siRNA雙重干擾，阻斷CTGF和TIMP-1的促肝纖維化形成作用，以探討肝纖維化的發(fā)病機(jī)制和防治方法。

我們針對(duì)每條目的基因分別設(shè)計(jì)了3個(gè)siRNA干擾候選靶位，分別轉(zhuǎn)染或不同組合后轉(zhuǎn)染經(jīng)TGF-β1刺激活化的大鼠肝星狀細(xì)胞，結(jié)果顯示每組CTGF-dsRNA可高效抑制CTGF及其下游產(chǎn)物procol-α1的表達(dá)，每組TIMP-1-dsRNA也可高度抑制TIMP-1及其下游產(chǎn)物procol-α1的表達(dá)，但不同的干擾靶位干擾效果有較大差異。CTGF和TIMP-1不同靶位RNA聯(lián)合干擾后，對(duì) CTGFmRNA、TIMP-1mRNA 和 procol-α1mRNA 表達(dá)的抑制效果較單獨(dú)干擾的抑制效果更強(qiáng)，說(shuō)明聯(lián)合應(yīng)用針對(duì)一個(gè)基因的多個(gè)siRNA，或同時(shí)干擾幾個(gè)基因，阻斷其生命周期的多個(gè)環(huán)節(jié)，能產(chǎn)生協(xié)同作用，并有可能減少由于點(diǎn)突變?cè)斐傻膶?duì)iRNA治療的耐受。另外，我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合干擾后，CTGF-3/TIMP-1-3組對(duì)CTGFmRNA和TIMP-1mRNA的抑制作用最強(qiáng)，而對(duì)procol-α1mRNA的抑制作用最強(qiáng)的卻是CTGF-2/TIMP-1-3組，可能與iRNA抑制的靶基因有關(guān)，尚需以后做進(jìn)一步的研究證實(shí)。肝纖維化指標(biāo)檢測(cè)也提示CTGF-3組和TIMP-1-3組單獨(dú)抑制PC III型、HA、LN最佳，而聯(lián)合干擾時(shí)，以CTGF-2/TIMP-1-3組對(duì)III型膠原、HA、LN的抑制作用最強(qiáng)。

由于機(jī)體的復(fù)雜性，ECM的合成和降解還受到許多因素的影響。因此，應(yīng)進(jìn)一步觀察CTGF和TIMP-1與TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系，不僅有助于進(jìn)一步闡明CTGF和TIMP-1在肝纖維化發(fā)生中的作用機(jī)制，也可能為肝纖維化的防治研究提供重要的途徑。

[1]丁寧.肝纖維化形成機(jī)制的研究進(jìn)展[J].臨床肝膽病雜志，2009，25（1）：73-77.

[2]王燕艷.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β與肝纖維化[J].實(shí)用醫(yī)技雜志，2010，17（5）：436-437.

[3]羅麗卿，吳平.肝星狀細(xì)胞結(jié)締組織生長(zhǎng)因子靶向siRNA與肝纖維化治療的研究進(jìn)展[J].廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，27（3）：305-306.

[4]孫華麗，張建軍.組織金屬蛋白酶及其抑制因子與肝纖維化[J].西南軍醫(yī)，2010，12（1）：81-83.

[5]MIYAGISHI M，TAIRA K.U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3'over-hangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cell[J].Nat Biotechnol，2002，20（5）:497-500.

[6]REYNOLDS A，LEAKE D，BOESE Q，et al.Rational siRNA design for RNA interference[J].Nat Biotechnol，2004，22（3）:326-330.

[7]余蓉，陳漢平，嚴(yán)小芳.單細(xì)胞實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)合比較閾值法在診斷唐氏綜合征中的應(yīng)用[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2007，24（2）：200-202.

[8]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南[J].實(shí)用肝臟病雜志，2006，9:8-18.

[9]LIU X，HU H，YIN JQ.Therapeutic strategies against TGF-beta signaling pathway in hepatic fibrosis[J].Liver Int，2006，26（1）:8-22.

[10]CHEN MH，CHEN JC，TSAI CC，et al.The role of TGF-beta 1 and cytokines in the modulation of liver fibrosis by Sho-saikoto in rat's bile duct ligated model[J].J Ethnopharmacol，2005，97（1）:7-11.