在非小細(xì)胞肺癌患者中甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白PTHrP的表達(dá)及其臨床意義

龔麗明 黃云超 李鴻鈞 歐霞 王東坤

1.昆明醫(yī)學(xué)院第四附屬醫(yī)院，云南省第二人民醫(yī)院心胸外科，云南 昆明 650021；2.昆明醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院胸心血管外科，云南 昆明 650118；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物研究所，云南 昆明 650118

肺癌是一常見惡性腫瘤，占癌癥相關(guān)死亡原因的首位，在環(huán)境污染及吸煙等易發(fā)因素影響下，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，病理學(xué)確診的病例中以非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的發(fā)病率最高。盡管吸煙都是引起男、女性患者發(fā)生肺癌的最主要原因，但是在臨床病理特點(diǎn)及生存率方面男、女性患者之間仍有不同，無論處于哪一期的女性患者，其預(yù)后往往比男性患者好［1］。因此探討肺癌發(fā)病機(jī)理、發(fā)展過程及臨床預(yù)后與性別的關(guān)系十分必要。大約2/3的NSCLC表達(dá)甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(parathyroid hormone-related protein，PTHrP)，該蛋白在結(jié)構(gòu)上與甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)相似，可導(dǎo)致惡性腫瘤高鈣血癥，還可改變癌細(xì)胞的增殖率、調(diào)節(jié)凋亡傾向并阻止腫瘤血管生成［2］。PTHrP的水平與性別及性激素的狀態(tài)相關(guān)［3］，有文獻(xiàn)報(bào)道女性肺癌患者PTHrP的水平較男性肺癌患者PTHrP的水平高，但仍缺乏PTHrP與患者生存率關(guān)系的研究。本實(shí)驗(yàn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)125例NSCLC腫瘤組織、癌旁組織及遠(yuǎn)端正常組織中PTHrP的表達(dá)，分析其與患者性別、組織分化程度、臨床分期及預(yù)后的相關(guān)性，探討在NSCLC患者中PTHrP的表達(dá)和女性患者生存期的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

125 例NSCLC腫瘤組織、癌旁組織及遠(yuǎn)端正常肺組織來自昆明醫(yī)學(xué)院第四附屬醫(yī)院和昆明醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院心胸外科2007年1月—2011年1月間手術(shù)切除標(biāo)本，所取標(biāo)本用10%甲醛固定后送病理科做組織蠟塊，男性73例，女性52例，年齡35～75歲，平均年齡54.5歲，中位年齡52歲。所有患者均行肺癌根治術(shù)，術(shù)前未經(jīng)化療或放療且經(jīng)過組織病理學(xué)診斷證實(shí)。按照WHO/IASLC肺上皮腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)(1999年)進(jìn)行組織學(xué)分類：鱗癌48例，腺癌65例，腺鱗癌12例；高分化癌20例，中分化癌66例，低分化癌39例。按國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC，2009年第7版)TNM分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期57例，Ⅲ期36例，Ⅳ期14例。隨訪時(shí)間從術(shù)后第1天至2011年1月16日。

1.2 試劑

抗PTHrP鼠抗人單克隆抗體(3D1.1)和UltraSensitiveTMSP試劑盒(KIT-9720)均由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供。

1.3 方法

標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)脫水包埋，做4 μm厚連續(xù)切片，分別進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色(SP法)。以EDTA抗原修復(fù)液直接煮沸抗原修復(fù)法修復(fù)組織抗原，已知陽性片作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

PTHrP蛋白以細(xì)胞質(zhì)染色呈棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)細(xì)胞。高倍鏡下(×400)每張切片計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，根據(jù)陽性反應(yīng)細(xì)胞所占百分比將結(jié)果分為：陰性(-)為0～＜10%；陽性(+)為10%～50%；強(qiáng)陽性(++)為＞50%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用χ2檢驗(yàn)、Fisher精確概率法和秩和檢驗(yàn)比較組間差異，用Kaplan-Meier曲線和Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸進(jìn)行多變量生存分析。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.5統(tǒng)計(jì)軟件分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PTHrP在NSCLC腫瘤組織、癌旁組織、遠(yuǎn)端正常肺組織中的表達(dá)

PTHrP在肺癌組織中陽性表達(dá)50例，強(qiáng)陽性表達(dá)32例，陽性率為65.6%；在癌旁組織中陽性表達(dá)19例，強(qiáng)陽性表達(dá)11例，陽性率為24.0%；在正常組織中陽性表達(dá)10例，強(qiáng)陽性表達(dá)11例，陽性率為16.8%。其中在癌旁組織及遠(yuǎn)端正常肺組織中的表達(dá)多呈陰性，在癌組織中的表達(dá)顯著強(qiáng)于癌旁組織及遠(yuǎn)端正常肺組織，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=70.130，P＜0.001，圖1，表1)。

表1 PTHrP在NSCLC腫瘤組織、癌旁組織及遠(yuǎn)端正常肺組織中的表達(dá)Tab.1 Expression of PTHrP in NSCLC cancer tissues, noncancerous adjacent lung tissues and normal lung tissues

PTHrP在NSCLC腫瘤組織的陽性表達(dá)率為65.6%，其中在腺癌、鱗癌及腺鱗癌中的陽性表達(dá)率分別為：70.8%、64.6%和41.7%，腺癌的陽性表達(dá)率較高，但組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=2.049， P=0.359)；PTHrP在癌旁組織中的陽性表達(dá)率是24.0%；在遠(yuǎn)端正常肺組織中的陽性表達(dá)率是16.8%。三者間兩兩比較，腫瘤組織與癌旁組織的PTHrP陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)；腫瘤組織與遠(yuǎn)端正常肺組織的PTHrP陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)；癌旁組織與遠(yuǎn)端正常肺組織的PTHrP陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.201)。三者比較PTHrP陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，其中在NSCLC腫瘤組織的陽性表達(dá)率最高。

2.2 在NSCLC組織中PTHrP的表達(dá)與患者各種臨床病理因素的關(guān)系

92例65 歲以下患者中PTHrP陽性表達(dá)63例(68.5%)；33例65歲以上患者中PTHrP陽性表達(dá)19例(57.6%)，兩組間PTHrP的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.258)。根據(jù)不同分期分組，PTHrP的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.732)。腺癌組、鱗癌組及腺鱗癌組間比較，PTHrP的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.147)。吸煙者與不吸煙者組間比較，PTHrP的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.692)。男性與女性組間比較，PTHrP的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。說明PTHrP的表達(dá)與年齡、臨床分期、組織學(xué)分型和吸煙史無關(guān)，但與性別相關(guān)，女性患者中PTHrP的表達(dá)較男性患者中PTHrP的表達(dá)高(表2)。

2.3 PTHrP在NSCLC組織中的表達(dá)與患者性別的關(guān)系

如表3所示，在女性患者和男性患者中，PTHrP的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，其中女性患者的表達(dá)最高(82.7%)；Ⅰ期患者不同性別的PTHrP表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023)，其中女性患者的表達(dá)最高(100%)，Ⅱ期患者不同性別的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.091)，Ⅲ和Ⅳ期患者不同性別的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.059)；腺癌組不同性別的PTHrP表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.056)，鱗癌組不同性別的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.035)，腺鱗癌組不同性別的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.092)；吸煙組不同性別的PTHrP表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.202)，不吸煙組不同性別的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。女性不吸煙者的陽性表達(dá)較高(80.9%)。

在所有患者、女性患者和男性患者中，PTHrP的表達(dá)在臨床Ⅰ～Ⅳ期中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；在腺癌、鱗癌和腺鱗癌組中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；在吸煙組和不吸煙組中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 PTHrP表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 The relationship between expression of PTHrP protein and NSCLC clinicopathologic factors

2.4 PTHrP在NSCLC組織中的表達(dá)與患者生存率的關(guān)系

Kaplan-Meier生存曲線顯示：在女性患者中PTHrP的表達(dá)與生存率相關(guān)(P＜0.001)，但是在男性患者中PTHrP的表達(dá)與生存率無關(guān)(圖2)。

在多變量分析中，有關(guān)吸煙史和PTHrP的表達(dá)情況均與患者的生存率相關(guān)。女性患者中，不管其是否吸煙，PTHrP表達(dá)陽性者較PTHrP表達(dá)陰性者有較長(zhǎng)的生存期(P＜0.05)；而男性患者中，從不吸煙者較少，其PTHrP的表達(dá)與生存率無關(guān)，吸煙者PTHrP的表達(dá)與生存率無關(guān)(圖3)。

3 討 論

PTHrP與PTH氨基端部分相似，有部分相似的功能，是一種分泌蛋白，可通過減少腎臟的鈣分泌、增加骨的鈣釋放而產(chǎn)生高鈣血癥［4］。該蛋白在胎兒肺、成人肺和肺癌中都有表達(dá)，在胎肺的發(fā)育、正常肺的生理、肺

損傷及肺癌的病理生理方面均有作用［5］。最早在BEN肺鱗癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)PTHrP，在55%～95%的肺癌細(xì)胞株和人類肺腫瘤中表達(dá)，約2/3的NSCLC患者表達(dá)PTHrP［6］。人類PTHrP基因位于12q29染色體，包含15個(gè)以上堿基、7個(gè)外顯子、6個(gè)內(nèi)含子、3個(gè)獨(dú)立的驅(qū)動(dòng)子和多個(gè)3’非編碼區(qū)域，而PTH位于11q39染色體，包含3個(gè)外顯子，通常認(rèn)為這兩個(gè)染色體在進(jìn)化方面有相關(guān)性，有一個(gè)共同的外顯區(qū)編碼前序列［7-8］。PTHrP通過影響細(xì)胞生長(zhǎng)周期而改變癌細(xì)胞的增殖率、調(diào)節(jié)凋亡傾向、調(diào)節(jié)integrin的大小和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)并阻止腫瘤血管生成，這種對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響能夠調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展、改變腫瘤的侵襲或轉(zhuǎn)移［9-11］、改變腫瘤對(duì)治療的敏感并在不同方面影響腫瘤的病理發(fā)生，從而可影響肺癌患者的生存率［12-13］。

表3 PTHrP表達(dá)與NSCLC患者性別的關(guān)系Tab.3 Demographic and lung cancer data by gender and PTHrP protein expression in NSCLC

圖2 不同性別NSCLC患者PTHrP的表達(dá)與其生存率的關(guān)系Fig.2 Kaplan-Meier survival curves for female and male patients with NSCLC as a function of tumor PTHrP A: Female; B: Male.

圖3 NSCLC患者的吸煙史、PTHrP的表達(dá)與其生存率的關(guān)系Fig.3 Survival curves for non-smokers versus smokers

大量的研究工作已經(jīng)評(píng)價(jià)了PTHrP在肺癌中導(dǎo)致高鈣血癥的作用，但揭示其在肺癌的進(jìn)展或生存預(yù)后方面的工作還很少，尤其是探討PTHrP的表達(dá)和女性肺癌患者生存優(yōu)勢(shì)之間關(guān)系的工作更少。近期國(guó)外的一些研究提示在肺癌中PTHrP的表達(dá)是一個(gè)有益的預(yù)后因子，女性肺癌患者PTHrP的水平較男性肺癌患者PTHrP的水平高［3，9-10］。Hastings等［10］觀察兩株正常情況下PTHrP表達(dá)陰性的肺腺癌細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染PTHrP后肺癌細(xì)胞的DNA合成受抑制，降低了肺癌細(xì)胞的增殖率，通過對(duì)細(xì)胞周期和分裂的影響減慢了肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Yamada等［14］和Bhatia等［15］分別用抗PTHrP抗體治療腫瘤患者，均降低了骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率，增加了腫瘤細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)NSCLC腫瘤組織、癌旁組織及遠(yuǎn)端正常肺組織中PTHrP的表達(dá)，分析其與患者臨床病理因素的相關(guān)性，比較陽性及陰性患者的生存率。研究發(fā)現(xiàn)約2/3的NSCLC中存在PTHrP的免疫反應(yīng)，PTHrP在肺癌組織中的表達(dá)顯著高于在非癌肺組織中的表達(dá)，在女性患者中腫瘤PTHrP的表達(dá)(82.7%)高于男性患者(53.4%)。PTHrP陽性更傾向于腺癌患者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.056)。在PTHrP陽性和PTHrP陰性的患者間，其臨床分期、組織學(xué)、吸煙史和年齡之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。生存率按患者性別分析有較大差異，男性患者中PTHrP陽性者的中位生存時(shí)間是27.14個(gè)月，PTHrP陰性者的中位生存時(shí)間是25.00個(gè)月，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明男性患者的生存率與PTHrP狀態(tài)無關(guān)；女性患者中PTHrP陽性的中位生存時(shí)間是38.62個(gè)月，PTHrP陰性者中位生存時(shí)間是20.00個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。用有吸煙史的所有女性患者的數(shù)據(jù)繪制的生存曲線顯示了一種傾向：PTHrP 陽性者有較長(zhǎng)的生存期。男性吸煙患者的生存曲線不受PTHrP狀態(tài)的影響。研究結(jié)果提示：在NSCLC患者中，女性PTHrP的表達(dá)率較男性高；PTHrP陽性的女性患者比男性患者有較長(zhǎng)的生存期；PTHrP陽性的女性患者生存期較PTHrP陰性的女性患者長(zhǎng)。從而提示PTHrP的表達(dá)可以作為女性NSCLC患者生存優(yōu)勢(shì)的一個(gè)有意義的預(yù)測(cè)指標(biāo)，但PTHrP是否為影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立因子還需要下一步的研究結(jié)果來確定。

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