高效液相色譜法測定杠板歸中槲皮素含量

楊佃志，戚秀萍

（山東醫(yī)藥技師學院，山東 泰安271000）

杠板歸為蓼科植物杠板歸（Polygonum perfoliatum（L.））的干燥地上部分。夏季開花時采割，本品為少數(shù)民族用藥，味酸、苦，性平，歸肺、小腸經(jīng)，具有清熱解毒、利濕消腫、散瘀止血的功效［1］。有文獻報道了采用雙波長薄層掃描測定杠扳歸糖漿中槲皮素的含量方法［2］，為更有效地對其進行質(zhì)量控制，本文建立了杠扳歸藥材中槲皮素的高效液相色譜測定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Water 600高效液相色譜儀，600泵；Water 2487紫外檢測器，威馬龍色譜工作站；電子天平（上海精密科學儀器有限公司），ODS Dikma C18色譜柱（4.6mm×150mm，5μm）。

1.2 材料

杠板歸，經(jīng)貴陽中醫(yī)學院中藥鑒定學教研室陳德媛教授鑒定為杠板歸，藥材60℃干燥30min，粉碎，過40目篩。槲皮素對照品（批號：100081－200406），購自中國藥品生物制品檢定所，純度為97.3%；水為雙重蒸餾水；甲醇為色譜純；其他試劑為分析純。

2 色譜條件

流動相：MeOH－0.2%磷酸（55∶45），流速：1.0mL／min；檢測波長360nm，柱溫30℃，進樣量為10μL，理論塔板數(shù)按槲皮素峰計算大于6 000。在此條件下，槲皮素峰的tR為14.7min，與相鄰峰分離良好（R＞1.5）。

圖1 杠板歸藥材HPLC色譜

3 方法學考察

3.1 對照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)120℃干燥至恒重后，精密稱取槲皮素對照品4.08mg，置于10mL量瓶，加甲醇9mL，超聲溶解，冷卻至室溫后加甲醇定容至刻度，搖勻即得槲皮素對照品儲備液（0.397mg／mL）。精密吸取儲備液2mL，置10mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，槲皮素對照品溶液（79.4μg／mL）。

3.2 樣品溶液的制備

精密稱取杠板歸粗粉0.5g，置于50mL圓底燒瓶中，精密加入20%鹽酸乙醇溶液25mL，水浴加熱回流提取2h，放冷，稱定重量，用甲醇補足減失重量，0.45μm微孔膜過濾，即得。

3.3 線性范圍關(guān)系考察

精密吸取儲備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mL，分別置于2mL量瓶中，加甲醇至刻度，混勻，按上述色譜條件分別進樣，測定峰面積。以槲皮素對照品溶液濃度為橫坐標Y，峰面積積分值為坐標X，繪制標準曲線，計算回歸方程為：Y＝2.64X×10－5＋3.81，r＝0.999 1（n＝5），表明槲皮素在19.8～198μg／mL的濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

3.4 重現(xiàn)性試驗

連續(xù)進樣6次，10μL／次，測定槲皮素標準品溶液的峰面積，RSD為1.22%。

3.5 精密度試驗

分別精密吸取5μL對照品溶液，日內(nèi)差試驗在同日內(nèi)測定，每個樣品重復進樣5次，RSD為2.40%（n＝5）；日間差試驗在連續(xù)5日內(nèi)測定，RSD為2.18%（n＝5）。通過對標準品日內(nèi)及日間進樣測定，結(jié)果表明精密度良好。

3.6 穩(wěn)定性試驗

按上述實驗方法稱取藥材0.601 1g制備樣品溶液，精密吸取10μL，每隔2h進樣1次，共進樣5次，RSD＝0.41，結(jié)果表明供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.7 加樣回收率試驗

精密稱取杠板歸藥材粗粉0.25g，取已知含量的供試液1.0mL6份，分別加入槲皮素標準溶液（2.420mg／mL）1mL混合均勻，測定含量，其平均回收率為100.37%，RSD為0.78%（n＝6）。結(jié)果見表1。

表1 槲皮素加樣回收率 （n＝6）

3.8 樣品含量測定

分別于貴陽萬東橋藥品交易市場購得貴州產(chǎn)杠板歸藥材3批，每批藥材取3份樣品，依上法測定含量，結(jié)果見表2。

4 結(jié)語

4.1 指標性成分的確定

由于國內(nèi)外對杠板歸尚未進行系統(tǒng)的化學成分研究，基礎(chǔ)研究很不充分。杠板歸中缺乏能夠直接測定的有效成分或指標成分，或含量太低。本實驗以槲皮索含量為指標成分，實驗表明本方法快速、簡便、準確，而且槲皮素本身具有祛痰、止咳、平喘作用，可作為杠板歸的質(zhì)量控制指標成分。

表2 杠板歸藥材含量測定

4.2 色譜條件的確定

4.2.1 檢測波長的選擇

取槲皮素對照品溶液，通過紫外掃描，溶液在254nm、360nm兩個波長時有明顯吸收。通過雙波長色譜圖分析，最后選擇360nm作為測定波長，結(jié)果比較理想，峰形較好，干擾較少。

4.2.2 流動相的選擇考察

本實驗用甲醇與0.2%磷酸（體積比45∶55）可將槲皮素與其他峰分離，且流動相配比簡單。在實驗中曾考察了甲醇－0.2%磷酸不同比例（體積比55∶50、50∶50、45∶55）。結(jié)果表明，流動相比例除對保留時間有一定影響外，對槲皮素峰的分離和峰純度無明顯影響。

4.3 提取及水解條件的選擇

杠板歸藥材中的槲皮素有一部分以苷元形式存在的，要將杠板歸藥材中的槲皮素提取出來，在實驗中對提取溶劑、提取方法、提取時間、加酸量進行了考察。結(jié)果表明，確定采用20%鹽酸的乙醇溶液加熱回流提取2h時，提取率較高。

杠板歸藥材因特有的療效而廣泛應(yīng)用于臨床，但關(guān)于其質(zhì)量評價方法的報道極少，本實驗為杠板歸藥材及其制劑的質(zhì)量控制提供了一種簡便準確的分析方法，值得推廣應(yīng)用。

［1］貴州省中藥材.民族藥材質(zhì)量標準［M］.貴州：貴州科技出版社，2003.

［2］謝輝，顧漢沖，許金宏.薄層掃描法測定杠板歸糖漿中槲皮素的含量［J］.南京中醫(yī)藥大學學報，1997，13（2）：88.