Siltuximab單克隆抗體對荷耐紫杉醇卵巢癌細(xì)胞株裸鼠腫瘤生長的影響*

郭玉琪，田 捧，路 平，趙瀟丹，DUANZhenfeng，張 展#

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科鄭州450052 2)哈佛大學(xué)麻省總醫(yī)院肉瘤實驗室波士頓MA02114

(2010-12-13收稿 責(zé)任編輯 姜春霞)

卵巢癌是嚴(yán)重危害婦女健康的三大癌癥之一，在我國其發(fā)生率居第3位，但病死率居婦科惡性腫瘤的首位。目前臨床對其治療仍以手術(shù)為主，同時配合放化療進行綜合治療。但多藥耐藥的形成限制了化療藥物的效果，是化療失敗的一個主要原因［1］。研究［2-3］發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素-6(IL-6)以及 IL-6激活Stat3與多藥耐藥的形成有關(guān)。在卵巢癌患者的血清和腹水中IL-6高水平存在，而且也發(fā)現(xiàn)IL-6產(chǎn)物在卵巢癌耐藥細(xì)胞株中增加［3-5］。對于卵巢癌來說，盡管IL-6作為一個腫瘤標(biāo)志物較CA125缺少敏感性，但其產(chǎn)生可能與腫瘤的侵襲和預(yù)后有關(guān)［3，5-6］。此外，研究［7］也表明，針對調(diào)節(jié) IL-6 通路的治療策略可能直接影響細(xì)胞對順鉑和阿霉素耐藥。作者前期的研究［8-9］顯示:Siltuximab體外可有效阻斷IL-6的信號傳導(dǎo)通路和IL-6介導(dǎo)的基因表達。為了進一步確定IL-6的信號傳導(dǎo)通路的阻斷對卵巢癌治療的意義，作者首先建立分泌高水平IL-6的耐藥卵巢癌細(xì)胞株的小鼠移植瘤模型，然后評估抗IL-6單克隆抗體Siltuximab對異種移植腫瘤的生長的影響，為探索治療卵巢癌的新策略提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和藥物 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素均購自美國Life Technologies公司(Grand Island，NY)?；|(zhì)膠由BD Biosciences公司提供。支原體檢測試劑盒購自美國Cambrex公司(Rockland，ME)?？笽L-6單克隆抗體Siltuximab和非特異性抗體F105由Centocor公司生產(chǎn)。紫杉醇由美國哈佛大學(xué)麻省總醫(yī)院提供。

1.2 細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3購自美國菌種保藏中心(Rockville，MD)。在美國哈佛大學(xué)麻省總醫(yī)院肉瘤實驗室建系的紫杉醇耐藥卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3TR的獲得參考文獻［10］。所有的細(xì)胞被培養(yǎng)在RPMI 1640培養(yǎng)基中，其中含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、0.1 U/L青霉素和0.1 mg/L鏈霉素。細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中，每2～3 d傳代一次。紫杉醇耐藥細(xì)胞株定期培養(yǎng)在含有200 mmol/L紫杉醇的培養(yǎng)基中以確認(rèn)其多藥耐藥性。用支原體檢測試劑盒定期檢測，以保持細(xì)胞沒有支原體污染。

1.3 實驗動物 該動物實驗方案經(jīng)美國哈佛大學(xué)麻省總醫(yī)院動物管理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號2004 N000296/1。選用 3～4周的 Crl:SHO-PrkdcSCIDHrhr雌性裸小鼠，購自 Charles River實驗室(Ann Arbor，MI)。

1.4 移植瘤小鼠模型的建立 選用3～4周的雌性裸小鼠36只，制備體內(nèi)異種移植瘤小鼠模型。在基質(zhì)膠中加入5×106mL－1的濃縮SKOV-3TR細(xì)胞懸液，然后取0.1 mL注入小鼠的背側(cè)面，所有動物的注射都需要有基質(zhì)膠的存在。

1.5 Siltuximab對腫瘤生長的影響 2周后，小鼠被分成6組。第1組(A組):用生理鹽水腹腔注射;第2組(B組):用非特異性抗體F105(20 mg/kg)腹腔注射;第3組(C組):用Siltuximab(20 mg/kg)腹腔注射;第4組(D組):用紫杉醇(20 mg/kg)腹腔注射;第5組(E組):用紫杉醇(20 mg/kg)和Siltuximab(20 mg/kg)混合腹腔注射;第6組(F組):用紫杉醇(20 mg/kg)和非特異性抗體F105(20 mg/kg)腹腔注射。紫杉醇(20 mg/kg)和Siltuximab(20 mg/kg)的劑量依據(jù)文獻［11-12］。以上6組小鼠，每周治療2次，持續(xù)5周。每天檢查小鼠健康狀況和腫瘤生長情況。用電子數(shù)字卡尺(游標(biāo)卡尺)每周測量2次腫瘤的大小，計算腫瘤體積。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學(xué)處理，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析比較各處理因素作用后不同時間點裸鼠移植腫瘤體積有無差異，檢驗水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

各組裸鼠移植腫瘤體積的比較見表1。

表1 各組裸鼠移植腫瘤體積的比較 mm3

3 討論

IL-6是一種多功能的抗腫瘤凋亡因子，是一種潛在的、臨床上非常重要的抗凋亡基因表達和耐藥的調(diào)節(jié)因子，阻斷IL-6和其下游的Stat3的促炎和抗凋亡的影響已經(jīng)成為卵巢癌治療中一個非常重要的努力方向。作者長期關(guān)注IL-6在藥物耐藥中的作用，已經(jīng)建立了許多紫杉醇耐藥細(xì)胞株，這些細(xì)胞株大多數(shù)高水平表達IL-6。此外，美國哈佛大學(xué)麻省總醫(yī)院肉瘤實驗室已經(jīng)建立了一個特殊的熒光Stat3細(xì)胞，以監(jiān)測腫瘤細(xì)胞系中IL-6介導(dǎo)的Stat3的激活。最近對卵巢癌耐藥細(xì)胞株的研究表明:Siltuximab能夠抑制IL-6介導(dǎo)的Stat3的磷酸化和核轉(zhuǎn)移，可顯著降低Stat3下游蛋白(如MCL-1、Bcl-XL和 Survivin)的表達水平［9-10］。研究［10］表明，經(jīng)過IL-6處理的SKOV-3細(xì)胞株中許多基因的表達水平發(fā)生了改變，而Siltuximab處理后，許多IL-6介導(dǎo)的基因的表達減弱。此外，Siltuximab還增加了紫杉醇在體外紫杉醇耐藥卵巢癌細(xì)胞株中的細(xì)胞毒作用。這些結(jié)果表明Siltuximab有效阻斷了IL-6的信號通路和IL-6介導(dǎo)的基因表達。

為了進一步確定IL-6的信號傳導(dǎo)通路的阻斷對卵巢癌治療的意義，作者首先建立了分泌高水平IL-6的耐紫杉醇卵巢癌細(xì)胞株的小鼠移植瘤模型，評估抗IL-6單克隆抗體Siltuximab對異種移植腫瘤生長的影響，結(jié)果顯示:Siltuximab對裸鼠體內(nèi)卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV-3TR移植瘤的生長無明顯影響。

動物實驗陰性的原因，一種可能是在該研究中使用的紫杉醇耐藥細(xì)胞株SKOV-3TR較敏感SKOV-3細(xì)胞株耐受100倍的紫杉醇，而治療劑量(20 mg/kg)的選擇是依據(jù)敏感的細(xì)胞株SKOV-3［12］。這種劑量(20 mg/kg)可能在抑制腫瘤生長時藥量不足。而增加紫杉醇的劑量也是不可能的，因為小鼠對紫杉醇的耐受是有限的。另一種可能性是Siltuximab抗體劑量(20 mg/kg)的選擇是基于文獻數(shù)據(jù)，這可能不是體內(nèi)抗耐藥細(xì)胞的最佳劑量。最后，Siltuximab抗體可能沒有滲透到腫瘤的有效部位。在對藥物抵抗卵巢癌的Siltuximab/紫杉醇聯(lián)合治療的臨床開發(fā)中，這些可能性應(yīng)優(yōu)先考慮。

Siltuximab對體內(nèi)腫瘤生長的影響及與紫杉醇的協(xié)同作用需要進一步的研究，為通過阻斷IL-6介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路，探索治療卵巢癌的新策略提供更多的依據(jù)。

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