香菇C91-3菌絲發(fā)酵液蛋白口服液抗腫瘤免疫機(jī)制的探討

鐘民濤，王曉麗，劉穎麗，劉 磊，李星云，張 偉，黃 敏

(大連醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，遼寧大連 116044)

香菇C91-3菌絲發(fā)酵液蛋白口服液抗腫瘤免疫機(jī)制的探討

鐘民濤，王曉麗，劉穎麗，劉 磊，李星云，張 偉，黃 敏

(大連醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，遼寧大連 116044)

［目的］探討香菇C91-3菌絲發(fā)酵液蛋白(LFP91-3)口服液的抑制腫瘤作用及機(jī)制。［方法］取60只昆明小鼠，隨機(jī)分6組后進(jìn)行S180荷瘤，并對(duì)荷瘤小鼠分別給予蒸餾水和不同劑量的LFP91-3口服，觀察劑量對(duì)小鼠生存期的影響，確定LFP91-3的最適劑量。同時(shí)觀察口服最適劑量后荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，血清IL-2和TNF-α含量的變化，以蒸餾水口服組為對(duì)照。［結(jié)果］LFP91-3口服液能延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期，且存在一定的劑量依賴關(guān)系。LFP91-3最適劑量組小鼠淋巴細(xì)胞增殖率，血清 IL-2和 TNF-α水平分別為(44.11±14.4)%，(48.33±16.7)pg/mL 和(84.27±16.88)pg/mL，明顯高于對(duì)照的蒸餾水組(18.04 ±8.72)%，(30.5 ±3.58)pg/mL 和(35.05±17.29)pg/mL，P＜0.05。［結(jié)論］LFP91-3口服液具有體內(nèi)抑瘤作用，其抑瘤作用可能與機(jī)體免疫能力提高有關(guān)。

香菇發(fā)酵蛋白;抗腫瘤;IL-2;TNF-α

香菇又名香蕈或香椹，是名貴的食藥用菌之一，國(guó)內(nèi)外對(duì)香菇多糖已有許多研究，認(rèn)為其具有抗病毒、抗腫瘤、抗感染、免疫調(diào)節(jié)和刺激干擾素形成等作用。目前，已經(jīng)開發(fā)出多種香菇多糖藥片和藥劑應(yīng)用于臨床，配合手術(shù)、化療和放療可以提高療效，延長(zhǎng)病人生存期［1-3］。香菇已被列為國(guó)內(nèi)重點(diǎn)研究的抗癌資源植物之一。

香菇C91-3菌株為黃敏等多年篩選的一株真菌，經(jīng)過生物發(fā)酵培養(yǎng)后，其發(fā)酵液具有明顯抗腫瘤作用［4-5］。香菇 C91-3菌絲發(fā)酵液蛋白(LFP91-3)是對(duì)香菇C91-3菌絲發(fā)酵液進(jìn)行初步提取獲得的混合蛋白，抗腫瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其具有體外直接殺傷腫瘤作用，在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)，但給藥途徑是腹腔注射給藥［6-8］。因此本研究改善給藥途徑，進(jìn)一步對(duì)LFP91-3口服液效果進(jìn)行研究，為今后研制有效的抗腫瘤新藥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:純系昆明小鼠，體重18～22 g，6～8周齡，雌雄各半(大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

1.1.2 香菇 C91-3菌絲:香菇 C91-3菌株由大連理工大學(xué)食用菌研究中心惠贈(zèng)。

1.1.3 瘤 株:S180(小鼠腹水型肉瘤細(xì)胞株)由本教研室提供。

1.1.4 主要試劑:RPMl-1640:GIBCO U.S.A;小牛血清:杭州四季青生物工程材料研究所;刀豆蛋白(ConA):中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司;四甲基偶氮唑蘭(MTT):北京華美生物工程公司;IL-2和TNF-α的ELISA試劑盒:武漢博士德生物工程有限公司;依多靈香菇菌多糖片(福建省閩東力捷迅藥業(yè)有限公司出品)。

1.1.5 主要儀器:真空干燥機(jī)(大連醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供);CO2孵育培養(yǎng)箱(Thermo公司);酶標(biāo)儀(BioRAD)。

1.2 方 法

1.2.1 LFP91-3的制備:香菇菌絲體發(fā)酵后收集發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)離心、鹽析、透析除鹽及濃縮，具體方法參照文獻(xiàn)［8］，最后制成口服液。

1.2.2 S180荷瘤小鼠模型的建立，動(dòng)物分組和給藥:S180腫瘤細(xì)胞連續(xù)在昆明小鼠腹腔傳代兩代以上，選傳代后6～7 d的小鼠，腹腔抽取腹水瘤細(xì)胞，Hanks液洗2次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5×107/mL。取60只昆明小鼠，0.2 mL/只于小鼠腹腔接種腫瘤細(xì)胞。荷瘤小鼠分別于建模24 h隨機(jī)分成6組:蒸餾水組、環(huán)磷酰胺(CTX)組、香菇多糖(LNT)組、香菇C91-3菌絲發(fā)酵液蛋白(LFP91-3)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組。每組10 只，荷瘤24 h 后分別予蒸餾水、CTX 0.6 mg、LNT 0.1 mg、LFP91-3125、250、500 μg，每次 0.5 mL/只，在第 1、3、5、7、9、11、13、15 天灌胃給藥，共計(jì) 8 次，分別觀察6組荷瘤小鼠的生存期，探討香菇LFP91-3的最適劑量。

1.2.3 荷瘤小鼠免疫功能指標(biāo)的測(cè)定:另取20只昆明小鼠，建模方法同上，荷瘤后隨機(jī)分為兩組:蒸餾水組、LFP91-3最適劑量組。每組10只，荷瘤24 h后分別予蒸餾水、LFP91-3最適劑量，每次 0.5 mL/只，給藥時(shí)間同上。于接種腫瘤細(xì)胞后第16天處死小鼠，各組小鼠分別摘除眼球取血，之后脫頸處死取脾進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

(1)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)實(shí)驗(yàn):各組小鼠脫頸處死后，無菌取脾，放入Hanks液中剪成糊狀(組織研磨器)，200目不銹鋼網(wǎng)(細(xì)胞網(wǎng))過濾分成單個(gè)脾細(xì)胞，無菌三蒸水休克Rbc 30 s，加等量體積1.7%無菌NaCl恢復(fù)等滲，加入5 mL Hanks液中，離心1500 r/min，10 min，棄上清，加 2 ～3 mL RPMl-1640 液1500 r/min離心5 min，洗2次后懸于培養(yǎng)液中，臺(tái)盼藍(lán)染色法判斷細(xì)胞活性在95%以上，調(diào)整濃度為5×106/mL。采用MTT比色法測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)［9］。

(2)血清IL-2和TNF-α含量的測(cè)定:將各組小鼠摘取的眼球血離心，制備血清。用小鼠IL-2和TNF-α的ELISA檢驗(yàn)試劑盒，按試劑盒上的說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 LFP91-3口服液對(duì)荷瘤小鼠生存期的影響

如表1所示，CTX組、LNT組和 LFP91-3組均能顯著延長(zhǎng)S180腫瘤細(xì)胞所致腹水型荷瘤小鼠的存活時(shí)間，與蒸餾水組比較差異具有顯著性意義(P＜0.05);LFP91-3Ⅰ組與CTX組的存活時(shí)間比較差異無顯著性意義(P ＞0.05);LFP91-3Ⅱ、Ⅲ組的存活時(shí)間均長(zhǎng)于CTX組和LNT組(P＜0.05)，且荷瘤小鼠的存活時(shí)間在適宜范圍內(nèi)隨LFP91-3濃度的增大而延長(zhǎng)，存在一定的劑量依賴關(guān)系。從而確定LFP91-3最適劑量為 LFP91-3500 μg。

表1 LFP91-3對(duì)S180荷瘤小鼠生存期的影響Tab 1 Effect of LFP91-3on life span in mice bearing S180 tumors

2.2 LFP91-3對(duì)荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞增殖率、血清IL-2和TNF-α含量的影響

荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞增殖率的測(cè)定結(jié)果見表2。LFP91-3最適劑量組小鼠的淋巴細(xì)胞增殖率明顯高于蒸餾水組(P ＜0.05)。而且，LFP91-3最適劑量組小鼠的IL-2和TNF-α含量與蒸餾水組比較，差異也有顯著性意義(P ＜0.05)，LFP91-3最適劑量組均高于蒸餾水組。

3 討 論

腫瘤傳統(tǒng)的治療方法有腫瘤切除手術(shù)、放療和化療，但給病人機(jī)體造成極大損傷，特別是對(duì)免疫系統(tǒng)的影響，往往會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視而形成擴(kuò)散或復(fù)發(fā)。免疫狀態(tài)低下是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征之一，香菇多糖雖已被證明具有抗腫瘤作用，并且是通過刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)增強(qiáng)其免疫功能來達(dá)到間接抗腫瘤的目的，但其能否直接殺傷腫瘤細(xì)胞還尚未有定論［10-11］。目前臨床上應(yīng)用香菇多糖(如天地欣等)作為輔助藥物參與腫瘤治療，有助于術(shù)后恢復(fù)［12］。環(huán)磷酰胺屬于臨床的化療藥物，雖能殺傷腫瘤細(xì)胞，但是其副作用大，并導(dǎo)致機(jī)體免疫功能低下。因此，在癌癥的治療中找到一種既殺傷腫瘤細(xì)胞又重建或增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的藥物具有相當(dāng)重要的意義［13］。

表2 LFP91-3對(duì)S180荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞增殖率、血清IL-2和 TNF-α的影響Tab 2 Effect of LFP91-3on lymphocyte proliferation，serum concentration of IL -2 and TNF- α within mice bearing S180 tumor

香菇C91-3菌絲發(fā)酵液蛋白(LFP91-3)已被證實(shí)具有體外直接殺傷腫瘤的作用，在體內(nèi)可抑制腫瘤生長(zhǎng)，但給藥途徑是腹腔注射給藥［8］。因臨床上口服給藥能顯著提高癌癥患者的生活質(zhì)量，且劑型易于制備，成本較低，使用時(shí)無需特殊護(hù)理，具有方便和經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)選用LFP91-3口服液對(duì)S180細(xì)胞荷瘤小鼠的抑瘤效果及其抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)香菇C91-3菌絲發(fā)酵液蛋白經(jīng)口服給藥后可明顯延長(zhǎng)S180荷瘤小鼠生存時(shí)間，抗腫瘤效果與香菇多糖和環(huán)磷酰胺無明顯差異，且荷瘤小鼠的存活時(shí)間在適宜范圍內(nèi)隨LFP91-3濃度的增大而延長(zhǎng)，存在一定的劑量依賴關(guān)系。同時(shí)，香菇菌絲發(fā)酵液蛋白LFP91-3口服后還能促進(jìn)荷瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞對(duì)ConA的增殖反應(yīng)，而且增加了IL-2和TNF-α的分泌。IL-2是由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，同時(shí)IL-2又可活化T和B細(xì)胞，參與細(xì)胞免疫功能。TNF-α能誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞的增生和分化，產(chǎn)生腫瘤特異性抗體，從而產(chǎn)生抗體介導(dǎo)的體液免疫抗瘤效應(yīng);同時(shí)，TNF-α能誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子激活巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞，并協(xié)同刺激T細(xì)胞增殖從而參與免疫調(diào)節(jié)，同時(shí)，淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)也是反映機(jī)體免疫功能的有效指標(biāo)［14-15］。提示 LFP91-3口服液抗腫瘤作用機(jī)制是通過調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能達(dá)到對(duì)腫瘤的抑制作用，至于LFP91-3口服后有沒有直接殺傷腫瘤作用，還有待深入研究。

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Anti- tumor effect of proteins from lentinus edodes C91-3mycelium's fermentative liquid in vivo

ZHONG Min -tao，WANG Xiao-li，LIU Ying-li，LIU Lei，LI Xing-yun，ZHANG Wei，HUANG Min
(Department of Microbiology，Dalian Medical University，Dalian116044，China)

Abstract:［Objective］The anti- tumor mechanism of oral protein liquid from C91-3lentinus fermentative liquid(LFP91-3)was studied in this experiment.［Methods］Sixty mice in the S180 tumor models were randomly divieded into 6 groups and then were orally given LFP91-3in different doses and water as control to research the effects of LFP91 -3 liquid，on survival and find the optimal dose of the drug.Then lymphocyte proliferation，and serum content changes of IL -2 and TNF-α of the mice in the optimal dose group were observed in comparison to those in water group.［Results］Oral LFP91-3liquid could prolong the survival time of mice in the S180 tumor models，the spleen lymphocyte proliferation rate and serum IL - 2 and TNF - α concentrations of the group with optimal dose of LFP91-3were(44.11 ± 14.4)%，(48.33 ±16.7)pg/mL，(84.27 ±16.88)pg/mL，respectively，being higher than those of group with water(18.04 ±8.72)%，(30.5 ±3.58)pg/mL，(35.05 ±17.29)pg/mL，(P＜0.05).［Conclusion］Oral LFP91-3liquid have potentiality to inhibit cancer，which maybe associate with immunity increasing effect of the drug.

Key words:lentinus edodes fermentative protein(LFP);anti-tumor;IL-2;TNF-α

R730.5

A

1671-7295(2011)06-0551-03

2011-06-22;

2011-09-26

鐘民濤(1978-)，遼寧大連人，講師，博士研究生。

黃 敏，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail:huangminchao@163.com