針刺對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠腦出血后灶周組織NF－κBp65表達(dá)和腦水含量的影響及其相關(guān)性分析

鄒偉，王瓏，李丹，孫曉偉，孔瑩

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

ICH是一種由于腦血管變性或破裂，大量血液滲入腦實(shí)質(zhì)內(nèi)，導(dǎo)致腦組織腫脹、充血、軟化引起的急性腦血管病。近年來(lái)許多研究表明，ICH繼發(fā)性腦損傷是出血性腦損傷的主要原因，ICH后血腦屏障被破壞形成腦水腫，腦水腫是腦組織開(kāi)始損傷及后續(xù)損傷嚴(yán)重性的一個(gè)標(biāo)志［1］。本研究旨在觀(guān)察頭穴透刺對(duì)ICH后炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用的NF－κBp65表達(dá)的影響及其與腦水腫發(fā)生的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)采用清潔級(jí)Wistar雄性大鼠，總計(jì)96只，體質(zhì)量(350±20)g，動(dòng)物于人工控制條件下飼養(yǎng)，保持室溫20℃，光照持續(xù)14h，黑暗10h。實(shí)驗(yàn)前正常飼養(yǎng)1周，造模大鼠術(shù)前禁食12h，禁水6h。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法［2］

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

健康雄性Wistar大鼠96只，采用完全隨機(jī)化設(shè)計(jì)，將其中90只隨機(jī)分為模型組、針刺組和西藥組，每組再按6h、1天、2天、3天、7天5個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分為5個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只大鼠，各亞組均建立ICH模型;另6只正常大鼠設(shè)為空白組。

1.2.2 ICH 模型的建立

參照鄒氏法制作ICH大鼠模型［3］。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的干預(yù)方法

空白組:不做任何干預(yù)措施。

針刺組:造模后，立即給予針刺治療(1次/天，30min/次);并給予類(lèi)西藥組lml生理鹽水灌胃(3次/天)。具體針刺方法:俯臥位捆綁固定大鼠，取病灶側(cè)百會(huì)進(jìn)針，用華佗牌28號(hào)1寸毫針透刺曲鬢，進(jìn)針約0.8寸，留針30min，采用捻轉(zhuǎn)行針手法，其間捻轉(zhuǎn)3次，每次2min，以200轉(zhuǎn)/min速度捻針。

西藥組:造模后，給予lml茴拉西坦稀釋液灌胃治療，3次/天;并給予類(lèi)針刺組捆綁30min/天。

模型組:造模后，給予類(lèi)西藥組lml生理鹽水灌胃，3次/天;并給予類(lèi)針刺組捆綁30min/天。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定

1.2.4.1 腦水含量的測(cè)定方法 參照干濕比重法進(jìn)行。

1.2.4.2 Western 蛋白免疫印跡法檢測(cè)

將腦組織標(biāo)本研磨成粉狀，每100mg組織中加入1ml RIPA 和 10ul PMSF，冰上勻漿，于 4℃、12 000r/min條件下離心20min，快速取上清，測(cè)定目的蛋白濃度，之后制備10%濃度的SDS－PAGE分離膠、5%的SDS－PAGE濃縮膠，室溫放置20min使其聚合完全。常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗4℃過(guò)夜及相應(yīng)二抗37℃孵育1h，ECL顯色后，避光孵育10min，曝光顯像。β－actin作為內(nèi)對(duì)照。利用凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像，并以灰度分析軟件進(jìn)行條帶灰度分析。分別測(cè)定每例樣品特異性目的條帶及其對(duì)應(yīng)的β－actin條帶的灰度值。按公式:相對(duì)灰度值=目的條帶的灰度值/同一標(biāo)本β－actin灰度值，計(jì)算每一樣品相應(yīng)指標(biāo)的相對(duì)灰度值，顯示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩兩比較采用LSD－t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 針刺對(duì)NF－κBp65蛋白免疫印跡表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各組不同時(shí)間點(diǎn)都有NF－κBp65蛋白表達(dá)，模型組從ICH后6h表達(dá)量開(kāi)始明顯增加，蛋白表達(dá)持續(xù)增強(qiáng)，于2天時(shí)間點(diǎn)達(dá)到高峰，并且除7天時(shí)間點(diǎn)外各時(shí)間點(diǎn)與空白組比較均有顯著性差異(P＜0.01);西藥組蛋白表達(dá)也在2天時(shí)間點(diǎn)達(dá)到高峰，但各時(shí)間點(diǎn)與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);針刺組在6h時(shí)表達(dá)一過(guò)性下調(diào)，隨后開(kāi)始增強(qiáng)，也在2天時(shí)間點(diǎn)達(dá)高峰，6h、1天和3天時(shí)間點(diǎn)與模型組和西藥組比較均有顯著性差異(P＜0.01)，見(jiàn)表1。

2.2 針刺對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠ICH后腦水含量的影響

空白組大鼠無(wú)腦水腫表現(xiàn)。造模后各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的腦水腫現(xiàn)象，與空白組比較有顯著性差異(P＜0.01)。其中針刺組在6h時(shí)間點(diǎn)，腦水腫程度較模型組及西藥組減輕，但差異不明顯(P＞0.05)。在其余時(shí)間點(diǎn)與模型組比較，腦水腫程度顯著減輕(P＜0.01);1天、2天和3天時(shí)間點(diǎn)與西藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);模型組大鼠術(shù)后6h出現(xiàn)輕度腦水腫現(xiàn)象，1天和2天時(shí)間點(diǎn)腦水含量明顯增加，高峰出現(xiàn)在3天時(shí)間點(diǎn)，造模后7天仍有輕度腦水腫現(xiàn)象。西藥組與模型組比較，1天、2天和3天時(shí)間點(diǎn)腦水腫程度較模型組明顯減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見(jiàn)表2。

表1 實(shí)驗(yàn)性ICH大鼠灶周腦組織NF－κBp65蛋白表達(dá)灰度值相對(duì)含量的比較(±s，n=6)

表1 實(shí)驗(yàn)性ICH大鼠灶周腦組織NF－κBp65蛋白表達(dá)灰度值相對(duì)含量的比較(±s，n=6)

注:針刺組與模型組比較，▲P＜0.01;針刺組與西藥組(茴拉西坦組)比較，●P＜0.01;模型組與空白組比較，★P＜0.01。

組別 n 6h 1天 2天 3天 7天空白組 6 0.248 ±0.034 0.248 ±0.034 0.248 ±0.034 0.248±0.034 0.248 ±0.034針刺組 30 0.220±0.056▲● 0.227±0.060▲● 0.432±0.066 0.236±0.042▲● 0.259±0.059模型組 30 0.373 ±0.070★ 0.440 ±0.076★ 0.465 ±0.058★ 0.405 ±0.074★ 0.251 ±0.079西藥組 30 0.384 ±0.079 0.430 ±0.076 0.470 ±0.078 0.409 ±0.080 0.266 ±0.048

表2 各組大鼠腦水含量比較(±s，%)

表2 各組大鼠腦水含量比較(±s，%)

注:針刺組與模型組比較，▲P＜0.01;針刺組與西藥組(茴拉西坦組)比較，●P＜0.05;西藥組與模型組比較，#P＜0.05;模型組與空白組比較，★P＜0.01。

組別 n 6h 1天 2天 3天 7天空白組 6 63.33 ±1.21 63.33 ±1.21 63.33 ±1.21 63.33 ±1.21 63.33 ±1.21模型組 30 67.83 ±1.47★ 79.00 ±1.55★ 81.67 ±2.07★ 84.17 ±1.47★ 67.17 ±1.47★西藥組 30 68.33 ±1.75 76.17 ±1.72# 77.83 ±1.47# 81.00 ±1.41# 66.50 ±1.05針刺組 30 67.33±1.97 71.33±1.21▲● 73.50±1.05▲● 75.33±1.86▲● 64.50±2.17▲

2.3 實(shí)驗(yàn)性大鼠ICH后灶周組織NF－κBp65表達(dá)和腦水含量的相關(guān)性分析

對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠ICH后腦組織NF－κBp65表達(dá)和腦水含量的相關(guān)性分析，得到回歸方程為:y=43.6x+59.1，r=0.60，對(duì)相對(duì)系數(shù) r采用 t檢驗(yàn)，P ＜0.01，表明二者呈正相關(guān)，如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)性大鼠ICH后灶周NF－κBp65表達(dá)與腦水含量的相關(guān)性分析

3 討論

3.1 針刺對(duì)ICH大鼠腦水含量影響的探討

大量研究證實(shí)［5］，ICH急性期炎癥反應(yīng)程度與血腫周?chē)X組織水腫及繼發(fā)性腦組織損害密切相關(guān)，是ICH后引起繼發(fā)性損害病理生理的重要環(huán)節(jié)。我們研究發(fā)現(xiàn)，在6天時(shí)間點(diǎn)，針刺組腦水腫程度較模型組減輕，提示針刺在ICH超早期有作用，在造模后3天時(shí)間內(nèi)，針刺組腦水腫程度均較模型組明顯減輕，說(shuō)明頭針療法在ICH后腦水腫高峰期有明顯作用;在造模后7天，針刺組腦水腫程度較模型組減輕，說(shuō)明在ICH后7天頭針透刺法依然發(fā)揮作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，針刺在ICH后腦水腫防治中發(fā)揮一定作用。

3.2 針刺對(duì)實(shí)驗(yàn)性ICH大鼠灶周腦組織NF－κBp65表達(dá)與腦水含量相關(guān)性分析

NF－κB作為一種多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，有關(guān)研究已證實(shí)，可高效誘導(dǎo)多種CK、黏附因子、趨化因子補(bǔ)體C3等的表達(dá)，同時(shí)對(duì)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的多種酶基因的表達(dá)也具有重要的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄作用［6－7］。

NF－κB作為一種重要的多靶位轉(zhuǎn)錄因子，可以在受損傷或存在大量炎癥介質(zhì)的組織細(xì)胞間激活［8］。ICH后NF－κB在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中起重要作用［9］，是炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)志物，NF－κB經(jīng)典的二聚體RelA(p65)和(p50)中僅p65含有激活轉(zhuǎn)錄的處理區(qū)。故此，本實(shí)驗(yàn)選用NF－κBp65作為指標(biāo)，觀(guān)察ICH后血腫周?chē)X組織NF－κB表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及頭針透刺對(duì)其變化的影響。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，正常大鼠腦內(nèi) NF－κBp65蛋白輕度表達(dá)，模型組ICH后血腫周?chē)X組織中NF－κBp65蛋白2天達(dá)高峰，此與吳家冥等［6］研究報(bào)道結(jié)果基本一致。針刺組對(duì)NF－κBp65蛋白表達(dá)表現(xiàn)出顯著下調(diào)作用，并且效果顯著優(yōu)于西藥組。由此可以推斷，下調(diào)腦內(nèi)NF－κBp65蛋白表達(dá)可能是針刺治療ICH獲效的又一個(gè)重要機(jī)制。

此外，許多研究也表明，NF－κBp65可能是導(dǎo)致出血后腦水腫的一個(gè)原因［10］。我們對(duì)NF－κBp65蛋白表達(dá)與腦水含量進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)呈正相關(guān)，表明在ICH早期可能隨著NF－κBp65表達(dá)的增加，激發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，繼而加重了腦水腫程度。針刺可能通過(guò)早期干預(yù)，抑制NF－κB的表達(dá)以及一系列免疫炎性反應(yīng)，從而對(duì)ICH后水腫程度起到抑制作用，發(fā)揮防治ICH后繼發(fā)性腦損傷的作用。

［1］ Wasserman JK，Schlichter LC.Minocycline protects the blood － brain barrier and reduces edema following intracerebral hemorrhage in the rat［J］.Exp Neuro，2007，207:227 － 237.

［2］ 王瓏，鄒偉，李丹，等.針刺對(duì)實(shí)驗(yàn)性ICH大鼠腦組織PAR－1表達(dá)的影響［J］.針灸臨床雜志，2010，26(2):48 －51.

［3］ 劉芳，鄒偉，張國(guó)威，等.針刺對(duì)ICH大鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因表達(dá)的影響［J］.針灸臨床雜志，2007，23(5):46 －49.

［4］ Gotoh O，Sano A，Koide T，et al.Ischemic brain edema following occlusion of the middle cerebral artery in the rat［J］.Stroke，1985，16(1):101－109.

［5］ 吳君倉(cāng)，群森，張持，等.ICH的病理?yè)p傷機(jī)制研究及相關(guān)治療進(jìn)展［J］.安徽醫(yī)學(xué)，2009，30(4):490 －492.

［6］ 吳家冥，周向陽(yáng)，儲(chǔ)照虎，等.實(shí)驗(yàn)性ICH后腦組織核因子－κB表達(dá)和含水量的變化及其相關(guān)性［J］.2007，20(2):128 －130.

［7］ 鄒偉，王瓏，李丹，等.針刺“百會(huì)”透“曲鬢”對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠腦出血后灶周組織PAR－1和NF－κBp65表達(dá)的影響及其相關(guān)性分析［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39(3):15 －18.

［8］ 楊繼文，龔樹(shù)輝，張利民，等.ICH后炎癥反應(yīng)的研究進(jìn)展［J］.腦與神經(jīng)疾病雜志，2009，17(4):317 －319.

［9］ Zhao X，Zhang Y，Strong R，et al.Distinct patterns of intracerebral hemorrhage－induced alterations in NF － kappaB subunit，iNOS，and COX －2 expression［J］.Neurochem，2007，101:652 －663.

［10］ 邰賀，成媛，劉鳴明，等.與腦出血發(fā)病機(jī)制相關(guān)的細(xì)胞及細(xì)胞因子的研究進(jìn)展［J］.臨床誤診誤治，2008，21(4):87 －89.