注射用七葉皂苷鈉無菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證

陳曉寧

（山東綠葉制藥有限公司，山東煙臺(tái) 264003）

注射用七葉皂苷鈉的主要成分為七葉皂苷鈉A和七葉皂苷鈉B，是從七葉樹科植物天師栗的干燥成熟種子中提取的一種含酯鍵的三萜皂苷，適用于腦水腫、創(chuàng)傷或手術(shù)所致腫脹，也用于靜脈回流障礙性疾病。本實(shí)驗(yàn)按照《中國藥典》2005年版要求對(duì)注射用七葉皂苷鈉現(xiàn)行檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證，以期建立注射用七葉皂苷鈉的無菌檢查方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HTY-2000A 智能集菌儀；一次性全封閉集菌培養(yǎng)器（DGB220、DGB330），分別由杭州高得、泰林醫(yī)療器械廠生產(chǎn)。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌[Staphylococcus aureus，CMCC（B）26003]，銅綠假單胞菌[Pseudomonas aeruginosa，CMCC（B）10104]，枯草芽孢桿菌 [Bacillus subtilis，CMCC （B）63501]， 生孢梭菌[Clostridium sporogenes，CMCC（B）64941]，白色念珠菌[Candida albicans，CMCC（F）98001]，黑曲霉[Aspergillus niger，CMCC（F）98003]，以上均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.3 培養(yǎng)基

商品脫水培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨均由北京三藥科技開發(fā)公司提供。

1.4 稀釋液和沖洗液

稀釋液和沖洗液均采用0.1%蛋白胨水溶液。

1.5 試藥

注射用七葉皂苷鈉（批號(hào)：200809042，規(guī)格：5 mg；批號(hào)：200811234，規(guī)格：10 mg；批號(hào)：200804124，規(guī)格：15 mg，檢品數(shù)量：120 支/批，山東綠葉制藥有限公司）。供試品藥液（注射用七葉皂苷鈉用0.1%蛋白胨水溶液進(jìn)行溶解、稀釋）。

2 方法與結(jié)果

潔凈度為100 級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，其環(huán)境潔凈度10 000 級(jí)。檢驗(yàn)全過程嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。

2.1 菌液制備[1-2]

接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48 h，上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每毫升含菌數(shù)小于100 cfu（菌落形成單位）的菌懸液。

接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23～28℃培養(yǎng) 5～7d，加入 3～5 ml 0.9%無菌氧化鈉溶液，將孢子洗脫，然后，吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無菌紗布能過濾菌絲的無菌毛細(xì)吸管）至無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氧化鈉溶液制成每毫升含孢子數(shù)小于100 cfu 的孢子懸液。

2.2 方法驗(yàn)證

按《中國藥典》2005年版[3]規(guī)定，取規(guī)定量的供試品按薄膜過濾法溶解、過濾、沖洗。過濾前先用少量沖洗液濕潤濾膜。過濾時(shí)，保持供試液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。將濾器中的溶液搖勻。每張濾膜每次沖洗量為100 ml，流速不易過快（以泵速為30～140 r/min 為宜），在最后一次的沖洗液中加入小于100 cfu 的試驗(yàn)菌，過濾。將硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌接種于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，白色念珠菌、黑曲霉接種于改良馬丁培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基加入量為100 ml/筒。陽性對(duì)照：另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為對(duì)照。按規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5d。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置30～35℃培養(yǎng)，改良馬丁培養(yǎng)基置23～28℃培養(yǎng)。各試驗(yàn)菌同法操作。陰性對(duì)照：取一套DGB220 濾器置于集菌儀上，取稀釋劑200 ml，與供試品同法操作，濾過。注入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基各100 ml，作為陰性對(duì)照。

2.3 結(jié)果

培養(yǎng)結(jié)果與對(duì)照管比較（如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長良好，則供試品的檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)），本品各容器中的試驗(yàn)菌均生長良好，照此檢查法和檢驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的無菌檢查[4-6]。注射用七葉皂苷鈉無菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果，見表1～3。

表1 注射用七葉皂苷鈉實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

上述結(jié)果表明，本品按《中國藥典》2005年版二部進(jìn)行無菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證，與對(duì)照管比較，含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長良好，表明在上述試驗(yàn)方法下該樣品對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌無抑菌作用或其抑菌作用忽略不計(jì)，符合《中國藥典》2005年版無菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證規(guī)定。所以注射用七葉皂苷鈉的無菌檢查可以用0.1%蛋白胨水溶液作為稀釋液和沖洗液，可以用薄膜過濾法檢驗(yàn)，沖洗量為100 ml/膜。

表2 注射用七葉皂苷鈉實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 注射用七葉皂苷鈉實(shí)驗(yàn)結(jié)果

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[4]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2005:313-321.

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