海洋新菌的分類與鑒定方法

金 光,張曉華

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,中國青島266003)

海洋新菌的分類與鑒定方法

金 光,張曉華＊＊

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,中國青島266003)

細(xì)菌的分類鑒定與細(xì)菌的研究和應(yīng)用有著同等重要的地位。目前從自然界中可以培養(yǎng)的細(xì)菌總量不到1%,大多數(shù)海洋細(xì)菌的分類鑒定仍需建立在純培養(yǎng)基礎(chǔ)上。本文對目前可培養(yǎng)海洋細(xì)菌的分類鑒定方法做了系統(tǒng)的綜述,詳述了系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建,匯總了生理生化分類特征,概述了主要的遺傳學(xué)分析方法,包括16S rDNA序列分析,G+C含量測定,DNA-DNA雜交,MLST(多位點(diǎn)序列分型,Multi Locus Sequence Typing)以及核酸指紋圖譜等,并指出每種方法適用的范圍以及應(yīng)用時需要注意的事項(xiàng)。另外,本文還提出了新菌分類鑒定的一般步驟。文章最后對目前海洋細(xì)菌分類鑒定的發(fā)展趨勢進(jìn)行了總結(jié)和展望。

海洋新菌;細(xì)菌分類鑒定;16S rDNA;生理生化;系統(tǒng)發(fā)生樹

細(xì)菌,作為地球上最古老也是分布最廣的生物,從海洋湖泊到人體表面[1],從火山口[2]到極地冰山[3],從海底熱泉[4]到放射性廢棄物[5]中,都能發(fā)現(xiàn)它們的身影。目前,根據(jù)2010年2月最新版細(xì)菌名錄,已正式發(fā)表的細(xì)菌種類達(dá)到9916種,且仍在快速增長,僅2010年1月份就新增48個新種[5]。然而,據(jù)估計(jì)自然界存在的細(xì)菌種類總數(shù)在105～106之間,還有巨大數(shù)量的細(xì)菌新種有待于科學(xué)家去發(fā)現(xiàn)。如何將新發(fā)現(xiàn)的種類區(qū)別于已發(fā)現(xiàn)的種類就需要對細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定。

細(xì)菌分類學(xué)由最初的德國植物學(xué)者F.Cohn把細(xì)菌分為球菌、短桿菌、長桿菌和螺旋菌四類開始,就進(jìn)入了經(jīng)典分類法時代。那時只是人為的選擇幾種形態(tài)和生理生化特征進(jìn)行分類,卻奠定了形態(tài)特征分類的基礎(chǔ)。1889年,M.W.Beijerinck以磷光素的生成為特征,建立了發(fā)光菌屬,開創(chuàng)了生理生化特征分類的新紀(jì)元。到了19世紀(jì)末期和20世紀(jì)初,生理生化特征逐漸成為細(xì)菌分類特征的主角。到了1980年代,分子生物學(xué)技術(shù)取得革命性突破,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和測序技術(shù)的發(fā)明使得16S rDNA序列分析法走進(jìn)了歷史舞臺,直至現(xiàn)在仍舊是細(xì)菌分類學(xué)的核心手段。同時,基于色譜分析和大分子空間結(jié)構(gòu)模擬技術(shù)等化學(xué)分類學(xué)手段也使細(xì)菌分類學(xué)更加多元化。細(xì)菌分類學(xué)走過了100多年的歷史,經(jīng)過不斷的豐富和發(fā)展,目前已走到包括形態(tài)、生理、生化、化學(xué)結(jié)構(gòu)、遺傳和分子圖譜多元化相結(jié)合的時代,即多相分類學(xué)(Polyphasic taxonomy)時代[6-7]。

細(xì)菌分類學(xué)包括細(xì)菌的特征描述、分類和命名三大要素。其中分類建立在充分的特征描述基礎(chǔ)上,良好的特征描述才能把不同的細(xì)菌種類區(qū)分開來。細(xì)菌的命名遵循國際微生物學(xué)會制定的國際細(xì)菌命名法規(guī)(International Code of Nomenclature of Bacteria),本文將不再討論。新種的分類和命名獲得認(rèn)可的途徑有2條:一是在國際微生物學(xué)會主辦的《International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology》(簡稱IJSEM)上發(fā)表;二是在IJ SEM以外的刊物發(fā)表的新種,須提交發(fā)表論文和保藏證書到IJ SEM編輯處申請,在J ISEM獲得認(rèn)可后即可成為新的模式種。需要注意的是,IJSEM和ICSP(International Committee on Systematics of Prokaryotes)要求提供新種在2個不同國家的菌種保藏中心的保藏證書。因此本文內(nèi)容也是遵循能夠在IJSEM上發(fā)表的原則進(jìn)行討論的。

由于技術(shù)手段的限制,能夠在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的細(xì)菌只占自然界細(xì)菌總數(shù)的1%[8-9]。海洋細(xì)菌具有獨(dú)特的生長環(huán)境,細(xì)胞大多呈革蘭氏陰性、不產(chǎn)芽孢、具有鞭毛、兼性好氧,生長溫度一般低于30℃,需要一定鹽度且生長緩慢。因此,海洋細(xì)菌的培養(yǎng)基一般是寡營養(yǎng)的,如Zobell 2216E培養(yǎng)基,海水培養(yǎng)基[7]等,以盡量接近自然海水的成分,而培養(yǎng)溫度一般為10～30℃,有的培養(yǎng)溫度更低。與陸生菌相比,許多海洋細(xì)菌在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上一般需5～7 d才可觀察,某些大洋水樣甚至要10 d以上。近年來發(fā)現(xiàn)了大量的海洋細(xì)菌新種,尤其在韓國、日本和中國。根據(jù)IJSEM網(wǎng)站(http:// ijs.sgmjournals.org/)提供的新種資料,作者統(tǒng)計(jì)了2009年1月至2010年3月在IJSEM上發(fā)表的細(xì)菌新種,海洋細(xì)菌新種占新菌總數(shù)的25%左右,中日韓三國所發(fā)表的海洋新菌數(shù)所占比例高達(dá)80%,而中國科研人員發(fā)表的海洋新種數(shù)超過海洋新菌總數(shù)的20%。作為海洋大國,中國在海洋細(xì)菌分離及分類鑒定領(lǐng)域必將迎來一個蓬勃發(fā)展的新時期。本文將以海洋新菌分類鑒定的一般步驟為主線,簡述各種細(xì)菌基因型和表現(xiàn)型分類特征及分類方法,并在每節(jié)后面提出了一些必須注意的事項(xiàng)。

1 16S rDNA序列測定

對1株未知菌株,可以按照圖1的流程進(jìn)行鑒定。首先,需要得到它的16S rDNA序列。16S rDNA在細(xì)菌中是高度保守的看家基因,因其在蛋白質(zhì)合成中的不可或缺的作用而成為細(xì)胞生存必需的基因。因此, 16S rDNA被廣泛用于原核生物的分類和鑒定以及系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的研究。16S rDNA序列全長約1500 bp,分為多個可變區(qū)和保守區(qū),因其獨(dú)特的分類學(xué)地位,設(shè)計(jì)了許多引物[10-12]。為了滿足后面比對和建立系統(tǒng)發(fā)生樹需要基因全長的要求,一般使用通用引物為B8F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3’,B1492:5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增[13]。采取TA克隆的辦法,以增加測序的準(zhǔn)確性,其保真度比直接測定PCR產(chǎn)物序列要高。

圖1 細(xì)菌分類鑒定的一般步驟流程圖Fig.1 Flow chart of general typing of bacteria

2 序列比對

當(dāng)?shù)玫酱ň甑?6S rDNA序列之后,將其與GenBank里的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對,可得到相似度最高的種。其中以相似度最高的數(shù)值作為結(jié)果,基本上可把目的菌株的范圍縮小到屬,甚至是種。目前公認(rèn)的并有大量文獻(xiàn)證明的結(jié)論是,當(dāng)相似度低于97%時,待定菌株是1個新種[14-17];二者相似度低于95%時,待定菌株是1個新屬。Yarza等通過大量其他分類學(xué)方法鑒定出新屬后對16S rDNA的分類意義做出評估,認(rèn)為以95%作為界定新屬的分界線是比較合理的[18]。

必須注意的事項(xiàng)有:

(1)有些學(xué)者認(rèn)為界定新種的相似度可以比97%更高。某些實(shí)例中確是如此[15],因此僅相似度不能完全確定1個新種,鑒定新種的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是DNA-DNA雜交。

(2)從GenBank中提取進(jìn)行序列比對的序列必須是標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rDNA序列。數(shù)據(jù)庫中序列來源相當(dāng)駁雜,大多數(shù)數(shù)據(jù)并不嚴(yán)謹(jǐn),只有標(biāo)準(zhǔn)菌株的數(shù)據(jù)才能采納。其菌株編號右上角有個字母“T”,如ATCC 14393T,T代表標(biāo)準(zhǔn)菌株。另外部分標(biāo)準(zhǔn)菌株的分類地位可能已發(fā)生改變,最好到IJSEM上查詢該菌株的最新發(fā)表文章進(jìn)行參考。

(3)若要建立新屬,應(yīng)與相近屬的菌種比較,其中最為重要的是該屬的標(biāo)準(zhǔn)種的標(biāo)準(zhǔn)菌株,因?yàn)橥瑢僦衅渌菢?biāo)準(zhǔn)種的分類地位將來可能會發(fā)生變化。

(4)Logan等建議,研究1個新種需要至少5個菌株,最好是不同來源的;若來源相同,應(yīng)該用核酸指紋技術(shù)確認(rèn)其非克隆性;應(yīng)該闡明菌株間的差異[19]。

3 系統(tǒng)發(fā)生樹分析

在得到待定菌株的16S rDNA序列的精確全長之后,要進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹分析。這時要查找該屬的最新鑒定文獻(xiàn),確保將所有近源種屬的模式種都加入到進(jìn)化樹中。建樹的算法主要分為2類:獨(dú)立元素法和距離依靠法。獨(dú)立元素法包括最大簡約法(Maximum parsimony)和最大似然法(Maximum likelihood);距離依靠法包括除權(quán)配對法(UPGMAM)和鄰位相連法(Neighbor-joining)。不同的算法有不同的適用目標(biāo)。最大簡約法適用于序列數(shù)目較多而差別較小的情況。最大可能性法在分析較多序列的時候耗時較長。UPGMAM法是假設(shè)進(jìn)化過程中只存在1個分子種。這種算法的結(jié)果不太準(zhǔn)確,現(xiàn)已很少使用。鄰位相連法是目前最常用的算法,其構(gòu)建的進(jìn)化樹相對準(zhǔn)確且計(jì)算快捷,但缺點(diǎn)是序列上的所有位點(diǎn)被同等對待,且所分析的序列間的進(jìn)化距離不能太大[20]。對進(jìn)化樹進(jìn)行評估,主要是采用自舉法(Bootstraping)。目前常用的建立系統(tǒng)發(fā)生樹的軟件有MEGA4,RAXML和PHYML[21]。

必須注意的事項(xiàng)有:

(1)建樹必須用高質(zhì)量的全長(或幾乎全長)序列。

(2)建樹之前需要對數(shù)據(jù)組的所有序列進(jìn)行對齊(A-lignment),對齊的途徑可以登錄網(wǎng)絡(luò)資源(ARB [www.arb-home.de],RDP[http://rdp.cme.msu. edu],SILVA[www.arb-silva.de],L TP[www.arbsilva.de/projects/living-tree/])或者求助于軟件(ClustalW,MEGA等)。

(3)鑒于引物的關(guān)系以及不同來源的16S rDNA序列大小不同,序列對齊之后需要進(jìn)行截取(Truncation),截取的原則是從所有序列都有重疊的第一個堿基始,到所有序列都有重疊的最后一個堿基止。

(4)在建樹時,必須標(biāo)注建樹的細(xì)節(jié),如用什么軟件,哪一種建樹方法,自舉次數(shù)等,以便別人可以對結(jié)果進(jìn)行重復(fù)。

4 基于遺傳學(xué)方法的其他鑒定技術(shù)

通過閱讀系統(tǒng)發(fā)生樹,可以對待定菌株的進(jìn)化位置及其可能的種屬已有了一個直觀的認(rèn)識。然而,由于16S rDNA的高度保守性,接下來要做的就是用分辨率更高的分析方法來鑒定和分類?，F(xiàn)代細(xì)菌分類學(xué)是在遺傳學(xué)研究方法的基礎(chǔ)之上建立起來的。這些方法概括起來可分為:

(1)基于DNA片段多樣性的分類方法,包括各種核酸指紋圖譜技術(shù)等;

(2)基于DNA序列多樣性的方法,包括全基因組測序, MLST,ITS(基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)),G+C含量分析等;

(3)基于核酸探針DNA雜交的方法,包括DNA-DNA雜交,DNA-RNA雜交,cDNA微陣列和寡核苷酸微陣列等。以下列舉其中一些常用的技術(shù)加以詳述。

4.1 G+C含量分析

同一菌種的不同菌株間G+C含量可能會有些許差別,但總體來說,每1個菌種的DNA中G+C含量是基本恒定的,不會隨著環(huán)境條件、培養(yǎng)條件等條件變化而變化,且在同1個屬內(nèi)的不同種之間,DNA中G+C含量的數(shù)值不會差異太大。一般認(rèn)為任何2個菌株G+C含量的差別超過10%,或者解鏈溫度(Tm)差超過5℃,這2株菌在分類上不是同1個種,因此可利用G+C含量來鑒別各種細(xì)菌種屬間的親緣關(guān)系及遠(yuǎn)近程度。

目前最常用的測定G+C含量的方法有熱變性溫度(Tm)測定法和高效液相色譜(HPLC)測定法。前者利用DNA由雙鏈變?yōu)閱捂湑r在260 nm處的紫外光吸收值不斷增加的原理確定其Tm值,然后根據(jù)公式計(jì)算出G+C含量。該法具有穩(wěn)定、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、儀器較易解決(只需帶加熱裝置的紫外風(fēng)光光度計(jì))等優(yōu)點(diǎn)。后者則是利用高效液相色譜儀將A、T、C、G 4種堿基依次分離4個峰,根據(jù)每種待測堿基的光吸收強(qiáng)度和譜峰面積分析結(jié)果。其優(yōu)點(diǎn)是靈敏、準(zhǔn)確、所需樣品少,但儀器昂貴且所提細(xì)菌純度要求高[22]。

值得注意的是,親緣關(guān)系相近的細(xì)菌,可推出G+ C含量相同或相似,反之則不然。如放線菌DNA的G +C在37%～51%之間,企圖在這么小的范圍內(nèi)區(qū)分放線菌的幾十個屬顯然是不現(xiàn)實(shí)的。因此,要比較2種細(xì)菌的DNA堿基對序列的排列是否相同,以及相同的程度如何,就需要做核酸雜交實(shí)驗(yàn)。

4.2 DNA-DNA雜交

核酸雜交技術(shù)由1960年代引入原核生物系統(tǒng)學(xué),包括DNA-DNA雜交技術(shù)和DNA-RNA雜交技術(shù)。目前比較常用的是DNA-DNA雜交技術(shù),后者已逐漸被16S rDNA測序技術(shù)所取代,就不做過多介紹。

DNA雜交法的原理是用DNA解鏈的可逆性和堿基配對的專一性,將不同來源的DNA在體外加熱解鏈,并在合適的條件下,使互補(bǔ)的堿基重新配對結(jié)合成雙鏈DNA,然后根據(jù)生成雙鏈的情況,檢測雜合百分?jǐn)?shù)。若2條單鏈DNA的堿基序列全部互補(bǔ),則他們能生成完整的雙鏈,即雜合率為100%;若2條單鏈DNA的堿基序列只有部分互補(bǔ),則他們僅部分生成雙鏈,即雜合率<100%。因此,雜合率越高,代表2個DNA之間堿基序列的相似度越高,它們之間的親緣關(guān)系也越近。如2株大腸埃希氏菌的DNA雜合率可高達(dá)100%,而大腸埃希氏菌和沙門氏菌的DNA雜合率較低,約為70%。G+C含量的測定結(jié)合DNA-DNA雜交實(shí)驗(yàn)將細(xì)菌分類帶到了堿基水平,現(xiàn)已成為新種鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。

目前DNA雜交大體分為固相雜交和液相雜交2種類型。固相雜交在過去30 a中應(yīng)用較為廣泛,它是利用1條核酸鏈固定在固體支持物上,另一條反應(yīng)核酸游離在溶液中,未雜交的游離片段可容易地的漂洗除去,因此具有容易檢測、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn),但操作步驟相對繁瑣。液相雜交則由于雜交后的過量探針去除較為困難,因此誤差較高。但近幾年經(jīng)過液相雜交技術(shù)的改良和商品化試劑盒的應(yīng)用,其精確度有所提高,且操作較為簡單,更適合于一般實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。

必須注意的事項(xiàng)有:(1)當(dāng)待定菌株與其最相近菌種的16S rDNA序列相似度低于97%時,可以不做DNA-DNA雜交試驗(yàn)。當(dāng)相似度高于97%時,所有與之相似度高于97%的菌株都應(yīng)該做。(2)DNA-DNA雜合率≥70%時,可以認(rèn)為二者屬于同1個種,但此標(biāo)準(zhǔn)不可絕對化?？赡艽嬖?個菌株的所有其他分類特征顯示為同1個種,但雜合率卻低于70%的情況[23-24]。(3)進(jìn)行G+C含量分析和DNA-DNA雜交分析之前一定要確保細(xì)菌DNA的質(zhì)量,否則會導(dǎo)致錯誤的結(jié)果。

4.3 核酸指紋圖譜

這一類技術(shù)包括AFLP(擴(kuò)增片段長度多態(tài)性), PFGE(脈沖電場凝膠電泳),RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析)和rep-PCR(重復(fù)序列PCR)。Rep-PCR又包括REP-PCR(基因外重復(fù)回文序列),ERIC-PCR(腸桿菌基因間重復(fù)一致序列PCR),BOX-PCR(boxA重復(fù)序列PCR),(GTG)5-PCR(GTG短重復(fù)序列PCR)和ribotyping(16S rRNA基因廣譜基因探針雜交)。一般來說,這類技術(shù)分辨率較高,但更適用于種內(nèi)關(guān)系的比較,比如可以用于測定B菌株是否是A菌株的克隆,還是另1個亞種。另外,除了AFLP和ribotyping技術(shù),其他核酸指紋圖譜技術(shù)通常由于各實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)方法的差異而導(dǎo)致相互之間的結(jié)果缺乏可比性。Pavel等則應(yīng)用(GTG)5-PCR將44個菌株鑒定到了種,結(jié)果證明這種方法用于腸球菌(Enterococci)的快速鑒定是比較可靠的[25]。

4.4 全基因組測序

隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展,測序所花費(fèi)的時間和金錢都大大降低,在不久的將來細(xì)菌全基因組測序技術(shù)可能會變?yōu)槌Ｒ?guī)手段。目前測序技術(shù)有Sanger測序法和焦磷酸測序法2種。Sanger法對基因組測序,需要先構(gòu)建650～800 bp的DNA文庫,輸出的最大通量為每0.44 Mb/7 h;而焦磷酸法不需要構(gòu)建文庫,且輸出通量高出許多,但每個片段僅有25～250 bp。目前最新的是454平臺,其中GS FLX系統(tǒng)升級了Titanium系列試劑后,每輪測序能產(chǎn)生100萬個讀長,每讀長增至400 bp,10 h通量可達(dá)到4～6億個bp,但精確度比Sanger稍差。由于焦磷酸法測序速度快,花費(fèi)低廉,在檢測基因突變和SNP(單核苷酸多態(tài)性)等需要大量檢測短序列的應(yīng)用中有不可比擬的優(yōu)勢[26-28]。Pierre等利用焦磷酸法測定了16S rDNA中的V6可變區(qū)序列,成功的對極地海洋的稀有細(xì)菌多樣性和豐度進(jìn)行了研究,并根據(jù)序列標(biāo)簽的匹配程度進(jìn)行了分類鑒定[29]。目前全基因組測序策略一般是先用焦磷酸法獲得框架圖,再用Sanger法補(bǔ)充低豐度區(qū)域獲得精細(xì)圖。雖然第1個細(xì)菌基因組的測通[30]證明了全基因組測序技術(shù)的強(qiáng)大,但是目前較高的花費(fèi)和較長的時間,還是限制了這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用。

4.5 MLSA/MLST(多位點(diǎn)序列分析/分型,Multi Locus Sequence Analysis/Typing)

16S rDNA在幾乎所有物種中都是高度保守的,因此它的分辨率僅能滿足屬以上水平的分類,若要鑒定到種,還需要其他分辨率更高的基因序列分析,這些基因同樣需要滿足高度保守但又含有可變區(qū)的條件,同時基因長度適中。一般需要7個左右的保守基因才能滿足要求,這種方法即前面所說的多位點(diǎn)序列分析/分型[31]。其他常用的基因有g(shù)yrB,recA,recG,rpoB,atpA,Hsp60等[32-33]。目前,除gyrB已有相對成熟的數(shù)據(jù)庫外,其他基因的數(shù)據(jù)庫(http://www.mlst.net; http://www.shigatox.net/cgi-bin/mlst7/dbquery; http://www.hpa-bioinformatics.org.uk/legionella/ legionella_sbt/php/sbt_homepage.php)大都較小。另外,所用引物并不是在每個種中都能擴(kuò)增出來,只能小范圍應(yīng)用于某些種,序列相似度的臨界值也難以界定,因此這種方法更適合于分析種內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。另外,有研究認(rèn)為MLST更適合跟蹤細(xì)菌群體結(jié)構(gòu)的長期變化,尤其是對基因重組率較高的種類進(jìn)行亞種的分型,如Neisseria meningitides[34],Streptococcus pneumoniae[35]和Enterococcus f aecalis[36]。MLSA雖然因此而受限,不過作為一項(xiàng)開放性技術(shù),隨著數(shù)據(jù)庫的不斷擴(kuò)容,不久的將來會得到更廣泛的應(yīng)用。

4.6 微陣列技術(shù)

cDNA微陣列技術(shù)一般是利用PCR擴(kuò)得的或者來自cDNA文庫的完整基因作為探針,它可以快速鑒定一些其他方法難以鑒定的分類特征,比如抗生素抗性、細(xì)胞毒性、血清型和流行性等,當(dāng)然也包括常見的一些看家基因[37-39]。cDNA微陣列技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是操作簡易,花費(fèi)低廉,結(jié)果易讀,但缺點(diǎn)是嚴(yán)謹(jǐn)性不夠。與cDNA微陣列技術(shù)相似的是寡核苷酸微陣列,它的探針較短,因而雜交結(jié)果更加嚴(yán)謹(jǐn),常用來檢測SNPs[40-41]。Wu等人構(gòu)建了群體基因組陣列(Community genome array,CGA)技術(shù),以此代替DNADNA雜交,對66株菌株進(jìn)行了分類比較分析,結(jié)果顯示CGA是1種高通量的檢測技術(shù),其相似度與用SSU (小亞基)基因序列、gyrB序列以及REP-PCR指紋圖譜等方法得出的結(jié)果呈線性關(guān)系[42]。

5 新種的描述

Tindall等在最新一篇關(guān)于細(xì)菌分類鑒定的文章中指出,“原核生物菌株的特征描述是其系統(tǒng)分類學(xué)的關(guān)鍵要素。不管是現(xiàn)代的新分類方法還是傳統(tǒng)方法都在秉持著這個要素。若需要鑒定的菌株是已知種,就需要選擇最少的試驗(yàn)來鑒定它屬于某已知的分類單元;若需要鑒定的菌株是新種,則需要用盡可能多的特征來描述,以方便將來其他相近分類單元進(jìn)行比較”。他們還強(qiáng)調(diào)“菌株的來源信息也要盡可能詳細(xì),包括菌株分離的地理位置(GPS或經(jīng)緯度),菌株編號以及環(huán)境信息(p H,溫度,鹽度,化學(xué)成分,在水中或土層中的深度)等”[43]。

其次,表型分類特征包括形態(tài)學(xué)特征、生理學(xué)特征、生化特征和化學(xué)特征(見表1)。大多數(shù)表型分類特征的具體實(shí)驗(yàn)方法可以在Tindall等的文章中查閱到[44]。

表1 細(xì)菌分類鑒定的表型特征Table 1 Phenotypes of identification and classification of bacteria

續(xù)表1

需要注意的事項(xiàng)有:

(1)最好使用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)步驟和培養(yǎng)基,并給出引用的最初來源。如有改動,需注明所得結(jié)果與原方法得出的結(jié)果的可比性。有一些特征也可以利用Biolog和API快速鑒定系統(tǒng)獲得結(jié)果,但是對海洋細(xì)菌的培養(yǎng)需要增加培養(yǎng)基質(zhì)的鹽度,而且必須和參考菌株同時進(jìn)行試驗(yàn),以保證結(jié)果的可靠性。

(2)通常來說,實(shí)驗(yàn)過程中需要設(shè)立1個或幾個對照,這些對照是與待定菌株最相近的菌株,且盡量都是標(biāo)準(zhǔn)菌株。對于對照菌株的使用,以前要求并不十分嚴(yán)格,但2009年以來IJSEM雜志要求必須使用盡可能多的相近菌種的標(biāo)準(zhǔn)菌株[43]。由于細(xì)菌脂肪酸的成分與培養(yǎng)條件密切相關(guān),因此進(jìn)行脂肪酸比較時待定菌株與對照菌株必須采用相同的培養(yǎng)條件。

(3)某些細(xì)胞壁缺陷型的革蘭氏陽性細(xì)菌會呈現(xiàn)陰性結(jié)果;革蘭氏染色結(jié)果會隨著細(xì)菌生長時期的不同發(fā)生變化。胞外多聚物,如多糖,需用墨汁制成菌懸液,然后做成濕涂片放在顯微鏡下觀察,細(xì)胞周圍有亮圈則說明胞外物質(zhì)的存在;脂溶性的細(xì)胞內(nèi)容物需用蘇丹黑染色[43]。

(4)苯醌包括泛醌,深紅醌和質(zhì)體醌。其中泛醌僅限于α-變形菌綱、β-變形菌綱和γ-變形菌綱的某些成員[45];最近報(bào)道浮霉?fàn)罹T(Planctomycete)發(fā)現(xiàn)的新種(Phycisphaera mikurensis)產(chǎn)生的主要呼吸醌是甲基萘醌6[46]。

(5)細(xì)菌所含脂類包括磷脂質(zhì),糖脂,磷糖脂,氨基磷脂,氨基酸衍生脂,鞘脂類和藿烷類。顯色時應(yīng)照顧到各種脂類的要求,否則結(jié)果會有偏差[43]。

6 結(jié)語

基因組時代的來臨使細(xì)菌的分類鑒定到達(dá)了1個嶄新的高度,目前海洋細(xì)菌分類手段的趨勢是信息化,全面化。Medini等發(fā)現(xiàn)用全基因組序列分析法和MLST法得出的Streptococcus agalactiae的基因組多樣性是不一致的[47]。這里需要引出泛基因組(Pan-genome)和核心基因組(Core genome)的概念。核心基因組包含在泛基因組之內(nèi),是由一菌種內(nèi)所有菌株的共有基因組成的基因組。產(chǎn)生上一現(xiàn)象的原因可能是全基因組分析法所分析的是泛基因組,而MLST法所使用的核心基因組里面缺少了一部分信息。MLST法中對保守基因的選取受限于所掌握已知基因的數(shù)量,而這種基于基因組信息的分類方法還有很多,如VNTRs (可變串聯(lián)重復(fù)片段),非編碼DNA和水平轉(zhuǎn)移基因等。全基因組測序給這些方法帶來了更豐富的遺傳信息,在側(cè)面上也豐富和完善了它們的應(yīng)用。

其次,分類手段趨于簡單化,標(biāo)準(zhǔn)化。DNA-DNA雜交技術(shù)由于復(fù)雜的操作和難于統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)一直受到詬病,但鑒于其在分類鑒定中的重要性,人們一直希望能找到合適的技術(shù)來代替它。全基因組時代的來臨使之成為了可能,目前最有希望的是ANI(平均核酸一致度)[48]和MUM(最大匹配片段)[49],它們本來是用來估算基因組配對的指數(shù),現(xiàn)在已被應(yīng)用于分類學(xué)。已有研究證實(shí)ANI與DNA-DNA雜交有很好的可比性, 95%～96%的ANI相當(dāng)于70%的DDH雜合度[24]。大腸桿菌基于抗體的分型由于其復(fù)雜的血清型而難于實(shí)現(xiàn),現(xiàn)在只要有O-/H-抗原基因,就可以制成寡核苷酸探針,從而利用微陣列技術(shù)使基于抗體分型的檢測在1個工作日內(nèi)完成[50-51]。

再次,分類手段多樣化,聯(lián)合化。目前用于細(xì)菌分類的方法越來越豐富,有基因雜交技術(shù),微陣列技術(shù),全基因組測序技術(shù),核酸指紋圖譜技術(shù)等等。然而,尚沒有任何一種方法可以以一代全,更多時候注重的是多種方法聯(lián)合使用。如核酸圖譜分析,MST(多間隔區(qū)分型)可能并不適用于種間的分類鑒定,而適用于鑒定基因突變或者種內(nèi)菌株間的差異,常結(jié)合16S rDNA序列分析技術(shù)加以分類;再如全基因組測序,雖然有提供遺傳信息最全面的優(yōu)勢,但高花費(fèi)和對測序DNA質(zhì)量的高要求使其還不能成為首選。因此,在進(jìn)行分類鑒定的時候,需根據(jù)具體的菌種和實(shí)驗(yàn)條件選擇最優(yōu)組合和最低標(biāo)準(zhǔn)(Minimal standards)。

最后,分類特征更加精細(xì)化。隨著新的海洋細(xì)菌被不斷發(fā)現(xiàn),也需要發(fā)現(xiàn)新的分類特征來更好的區(qū)分不同的分類單元,新的研究方法和對象帶來了新的分類特征。99%的海洋細(xì)菌都未被培養(yǎng),目前各國科學(xué)家都在集中研究新的培養(yǎng)方法。新的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基也將成為一種新的分類特征。另外,流行病生物學(xué)特征的發(fā)展也為細(xì)菌分類提供了更廣闊的依據(jù),如細(xì)菌毒性、抗生素抗性、宿主適應(yīng)性、流行性暴發(fā)等,尤其是將這些特征與相應(yīng)的基因型相結(jié)合[52],這將是未來細(xì)菌分類鑒定的一個新的發(fā)展方向。

[1] Frank D N,Spiegelman GB,Davis W,et al.Culture-independent molecular analysis of microbial constituents of the healthy human outer ear[J].J Clin Microbiol,2003,41:295-303.

[2] Dymond J,Collier R W,Watwood M E.Bacterial mats from Crater Lake,Oregon and their relationship to possible deep-lake hydrothermal venting[J].Nature,1989,342,673-675

[3] InouéK,Komagata K.Taxonomic study on obligately psychrophilic bacteria isolated from Antarctica[J].J Gen Appl Microbiol, 1976,22:165-178.

[4] Zierenberg R A,Adams M W,Arp A J.Life in extreme environments:Hydrothermal vents[J].Proc Nati Acad Sci,2000,97 (24):12961-12962.

[5] Phillips R W,Wiegel J,Berry C J,et al.Kineococcus radiotoleranssp.nov.,a radiation-resistant,Gram-positive bacterium[J]. Int J Syst Evol Microbiol,2002,52:933-938.

[6] 謝文陽.細(xì)菌分類的濫觴和演變[J].科學(xué)發(fā)展,2006,408:58-67.

[7] 張曉華.海洋微生物學(xué)[M].青島:中國海洋大學(xué)出版社,2007: 337.

[8] Amann R I,Ludwig W,Schleifer K H.Phylogenetic identification andin situdetection of individual microbial cells without cultivation[J].Microbiol Rev,1995,59:143-169.

[9] Kaeberlein T,Lewis K,Epstein S S.Isolating‘uncultivable’microorganisms in pure culture in a simulated natural environment [J].Science,2002,296:1127-1129.

[10] Lane D J.16S/23S rRNA sequencing[M].∥E.Stackebrandt and M.Goodfellow,Nucleic acid techniques in bacterial systematics.New York:John Wiley&Sons,NY.1991:115-147.

[11] Marchesi J R,Sato T,Weightman A J.Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA[J].Appl Environ Microbiol,1998,64: 795-799.

[12] Stackebrandt E,Liesack W.Nucleic acids and classification.∥M.Goodfellow and A.G.O’Donnell,Handbook of new bacterial systematics[M].London,England:Academic Press,1993: 152-189.

[13] Heuer H,Krsek M,Baker P,et al.Analysis of Actinomycetecommunities by specific amplification ofgenes encoding 16S rRNA and gel-electrophoretic separation in denaturing gradients [J].Appl Env Microbiol,1997,63:3233-3241.

[14] Amann R I,Lin C,Key R et al.Diversity amongFibrobacterisolates:towards a phylogenetic and habitat-based classification [J].Syst Appl Microbiol,1992,15:23-31.

[15] Fox G E,Wisotzkey J D,Jurtshuk P J.How close is close:16S rRNA sequence identity may not be sufficient to guarantee species identity[J].Int J Syst Bacteriol,1992,42:166-170.

[16] Collins M D,Rodrigues U,Ash C,et al.Phylogenetic analysis of the genusL actobacillusand related lactic acid bacteria as determined by reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA[J]. FEMS Microbiol Lettl,1991,77:5-12.

[17] Martínez-Murcia A J,Benlloch S,Collins M D.Phylogenetic interrelationships of members of the generaAeromonasandPleisiomonasas determined by 16S ribosomal DNA sequencing:lack of congruence with results of DNA-DNA hybridizations[J].Int J Syst Bacteriol,1992,42:412-421.

[18] Yarza P,Richter M,Peplies J,et al.The all-species living tree project:a 16S rRNA-based phylogenetic tree of all sequenced type strains[J].Syst Appl Microbiol,2008,31:241-250.

[19] Logan N A,Berge O,Bishop A H,et al.Proposed minimal standards for describing new taxa of aerobic,endospore-forming bacteria[J].Int J Syst Evol Microbiol,2009,59:2114-2121.

[20] Nei M and Kumar S.Molecular evolution and phylogenetics [M].New York:Oxford University Press,2000:52-207.

[21] Tamura K,Dudley J,Nei M,et al.MEGA4:Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)Software Version 4.0[J]. Mol Biol Evol,2007,24:1596-1599.

[22] 李琳,李槿年,余為一.細(xì)菌染色體DNA G+C mol%含量測定方法研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2003,24(1):50-52.

[23] Ursing J B,Rosselló-Mora R A,García-Valdés E,et al.Taxonomic note:a pragmatic approach to the nomenclature of phenotypically similar genomic groups[J].Int J Syst Bacteriol,1995, 45:604.

[24] Goris J,Konstantinidis K T,Klappenbach J A,et al.DNADNA hybridization values and their relationship to whole-genome sequence similarities[J].Int J Syst Evol Microbiol,2007,57: 81 91.

[25] Pavel S,Marc V,Milan S et al.Evaluation of(GTG)5-PCR for identification ofEnterococcusspp.[J].FEMS Microbiol Lett, 2005,247:59-63.

[26] Arnold C,Westland L,Mowat G,et al.Single-nucleotide polymorphism-based differentiation and drug resistance detection in Mycobacterium tuberculosisfrom isolates or directly from sputum [J].Clin Microbiol Infec,2005,11:122-130.

[27] Jureen P,Engstrand L,Eriksson S,et al.Rapid detection of rifampin resistance inMycobacterium tuberculosisby pyrosequencing technology[J].J Clin Microbiol,2006,44:1925-1929.

[28] Clarke S C.Pyrosequencing:nucleotide sequencing technology with bacterial genotyping applications[J].Expert Rev Mol Diagn,2005,5:947-953.

[29] Pierre E G,Emilio O C,David L K,et al.Ecological of the rare microbial biosphere of the Arctic Ocean[J].PNAS,2009,106: 22427-22432.

[30] Fleischmann R D,Adams M D,White O,et al.Whole-genome random sequencing and assembly ofHaemophilus inf luenzaeRd [J].Science,1995,269:496-512.

[31] Spratt B G.Multilocus sequence typing:molecular typing of bacterial pathogens in an era of rapid DNA sequencing and the internet[J].Curr Opin Microbiol,1999,2:312-316.

[32] Scott R S,Howard O.Identification and phylogenetic sorting of bacterial lineages with universally conserved genes and proteins [J].Environ Microbiol,2004,6(7):754-759.

[33] Wang L T,Lee F L,Tai C J,et al.Comparison ofgyrBgene sequences,16S rRNA gene sequences and DNA-DNA hybridization in theBacillus subtilisgroup[J].Int J Syst Evol Microbiol, 2007,57:1846-1850.

[34] Maiden M C,Bygraves J A,Feil E,et al.Multilocus sequence typing:a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms[J].P Natl Acad Sci, USA,1998,95:3140-3145.

[35] Enright M C,Spratt B G.A multilocus sequence typing scheme forStreptococcus pneumoniae:identification of clones associated with serious invasive disease[J].Microbiology,1998,144: 3049-3060.

[36] Ruiz-Garbajosa P,Bonten M J,Robinson D A,et al.Multilocus sequence typing scheme forEnterococcus f aecalisreveals hospital-adapted genetic complexes in a background of high rates of recombination[J].J Clin Microbiol,2006,44:2220-2228.

[37] Borucki M K,Kim S H,Call D R,et al.Selective discrimination ofListeria monocytogenesepidemic strains by a mixed-genome DNA microarray compared to discrimination by pulsed-field gel electrophoresis,ribotyping,and multilocus sequence typing[J].J Clin Microbiol,2004,42:5270-5276.

[38] Cleven B E,Palka-Santini M,Gielen J,et al.Identification and characterization of bacterial pathogens causing bloodstream infections by DNA microarray[J].J Clin Microbiol,2006,44:2389-2397.

[39] Duggan D J,Bittner M,Chen Y,et al.Expression profiling using cDNA microarrays[J].Nat Genet,1999,21:10-14.

[40] Iwasaki H,Ezura Y,Ishida R,et al.Accuracy of genotyping for single nucleotide polymorphisms by a microarray-based single nucleotide polymorphism typing method involving hybridization of short allele-specific oligonucleotides[J].DNA Res,2002,9:59-62.

[41] Zwick M E,Mcafee F,Cutler D J,et al.Microarray-based resequencing of multipleBacillus anthracis isolates[J].Genome Biol,2005,6:R10.

[42] Wu L Y,L XD,Matthew W F,et al.Microarry-based whole-genome hybridization as a tool for determining prokaryotic species relatedness[J].ISME Int Socie Microbial Eco,2008,2:642-655.

[43] Tindall B J,Rossello-Mora R,Busse H J,et al.Notes on the characterization of prokaryote strains for taxonomic purposes [J].Int J Syst Evol Microbiol,2010,60:249-266.

[44] Tindall B J,Sikorski J,Smibert R M,et al.Phenotypic characterization and the principles of comparative systematics.∥Reddy C A,Beveridge T J,Breznak J A.Methods for General and Molecular Microbiology[M].Washington DC:ASM Press,2007:330-393.

[45] Tindall B J.Respiratory lipoquinones as biomarkers[M].∥Akkermans A,de Bruijin F,Van Elsas D.Molecular Microbial Ecology Manual.Dordrecht,Netherlands:Kluwer Publishers, 2005.

[46] Yukiyo F,Midori K,Yayoi S,et al.Phycisphaera mikurensis gen.nov.,sp.nov.,isolated from a marine alga,and proposal ofPhycisphaeraceaefam.Nov.,Phycisphaeralesord.nov.and Phycisphaerae classis nov.in the phylumPlanctomycetes[J].J Gen Appl Microbiol,2009,55:267-275.

[47] Medini D,Donati C,Tettelin H,et al.The microbial pan-genome[J].Curr Opin Genet Dev,2005,15:589-594.

[48] Li W J,Didier R,Pierre-Edouard F.Bacterial strain typing in the genomic era[J].FEMS Microbiol Rev,2009:1-25.

[49] Marc D,Meriem E K,Marie-Agnes P.A genomic distance based on MUM indicates discontinuity between most bacterial species and genera[J].J Bacteriol,2009,191:91-99.

[50] Ballmer K,Korczak B M,Kuhnert P,et al.Fast DNA serotyping ofEscherichia coliby use of an oligonucleotide microarray [J].J Clin Microbiol,2007,45:370-379.

[51] Liu Y,Fratamico P.Escherichia coliO antigen typing using DNA microarrays[J].Mol Cell Probes,2006,20:239-244.

[52] Caws M,Thwaites G,Dunstan S,et al.The influence of host and bacterial genotype on the development of disseminated disease withMycobacterium tuberculosis[J].PLoS Pathog,2008,4: e1000034.

Abstract: The importance of the Bacteria identification is equal to its investigation and application.Currently,culturable bacteria account for less than 1%of total bacteria,most of which need to be identified base on pure culture.The paper summed up the technologies of identifying culturable marine bacteria, dwelled on the establishment of phylogenetic tree and compiled physiological and biochemical traits.The mainly used genetic methods include 16S rDNA sequence analysis,G+C content,DNA-DNA hybridization,MLST and nuclear acid fingerprint mapping,etc.Applicability and items that attracting notice were also given.In addition,the general protocol for identifying of novel marine bacteria was suggested.Finally,the present situation was concluded and the future of bacteria identification was prospected.

Key words: novel marine bacteria;bacteria identification;16S rDNA;physiological and biochemical; phylogenetic tree

責(zé)任編輯 于 衛(wèi)

Technologies for Identification of Novel Marine Bacteria

J IN Guang,ZHANG Xiao-Hua
(College of Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Q939.1

A

1672-5174(2011)04-069-08

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA09Z434)資助

2010-03-24;

2010-05-24

金 光(1981-),男,博士生;研究方向:海洋微生物學(xué)。

E-mail:xhzhang@ouc.edu.cn