飼料中添加還原型谷胱甘肽對牙鲆生長和抗氧化能力的影響

王芳倩,張文兵,麥康森,徐瑋,王小潔,劉付志國

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266003)

飼料中添加還原型谷胱甘肽對牙鲆生長和抗氧化能力的影響

王芳倩,張文兵＊＊,麥康森,徐瑋,王小潔,劉付志國

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266003)

以酪蛋白、明膠為主要蛋白源配制精制基礎(chǔ)飼料,添加不同濃度梯度的還原型谷胱甘肽(GSH),飼料中GSH的含量分別為0、97.96、189.92、371.84、688.72和1 063.56 mg·kg-1,在流水式養(yǎng)殖系統(tǒng)中分別投喂初始體質(zhì)量為(9.49± 0.22)g的牙鲆(Paralichthys olivaceus)幼魚,8周后觀測各組牙鲆的生長情況及機(jī)體的抗氧化狀態(tài)。結(jié)果表明,飼料中添加外源的GSH對牙鲆成活率沒有顯著影響(P>0.05);牙鲆增重率(WGR)在飼料GSH含量為371.84 mg·kg-1時(shí)達(dá)到最大值,顯著高于其它各組(P<0.05);飼料GSH添加組牙鲆肝臟中GSH的含量顯著高于零添加組(P<0.05);各處理組肝臟中丙二醛(MDA)的含量沒有顯著差異(P>0.05);肝臟中谷胱甘肽還原酶(GR)的活力隨飼料中GSH含量的升高呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢,并在飼料中GSH含量為371.84 mg·kg-1時(shí)達(dá)到最低值;肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活力沒有受到飼料中GSH含量的顯著影響(P>0.05);飼料中GSH含量為371.84 mg·kg-1時(shí),肝臟中總抗氧化力(T-AOC)顯著高于1 063.56 mg·kg-1組(P<0.05),谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活力顯著低于其它各組(P<0.05)。根據(jù)WGR的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),利用折線模型得到牙鲆幼魚飼料中GSH的適宜含量為368.92 mg·kg-1,過高或過低都會(huì)對生長造成負(fù)面影響,抑制機(jī)體抗氧化能力,增加機(jī)體氧化壓力。

牙鲆;飼料;谷胱甘肽;生長;抗氧化

還原型谷胱甘肽(GSH)是由γ-谷氨酰環(huán)化轉(zhuǎn)移酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶催化細(xì)胞內(nèi)谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸脫水而成的含有巰基的天然三肽,體內(nèi)主要由肝臟合成,與氧化型谷胱甘肽(GSSG)相互轉(zhuǎn)化,以維持細(xì)胞正常的生理過程[1-2]。哺乳動(dòng)物中的研究發(fā)現(xiàn),外源型GSH可以被小腸直接吸收進(jìn)入血液循環(huán)[3-4],食物中補(bǔ)充GSH在機(jī)體內(nèi)可以起到清除自由基、緩解缺血性再灌注損傷[5]、防止脂質(zhì)過氧化[6]等多種生理功能。另外,GSH作為Ⅱ相解毒酶——谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的作用底物,參與機(jī)體的解毒作用,能夠與毒素結(jié)合形成1種新的可溶性物質(zhì),使毒素的毒性大大降低[7]。

水生動(dòng)物體內(nèi)GSH水平對外界條件的變化很敏感[8-9],體內(nèi)的GSH在魚體解除重金屬毒性[10],免受多氯聯(lián)苯的氧化損傷[11],提高抵抗微囊藻毒素毒性的能力[12]等方面起到了重要的作用;同時(shí),影響草魚[13]和凡納濱對蝦[14]的生長和抗氧化能力。目前,關(guān)于水產(chǎn)飼料中應(yīng)用GSH的研究主要集中于淡水魚和蝦類。凡納濱對蝦飼料中添加GSH可以提高體內(nèi)過氧化物酶活性[14]、提高肝胰腺抗氧化能力和降低脂質(zhì)過氧化水平[15]、提高GSH在體內(nèi)的蓄積[16-17]。草魚飼料中添加GSH可以提高特定生長率、成活率、飼料轉(zhuǎn)化率和血清中IGF-1的水平[13],同時(shí)提高肝臟和肌肉中GSH的沉積和抗氧化能力[18]。飼料中添加100～400 mg·kg-1的GSH,能夠顯著增強(qiáng)羅非魚的攝食和生長,提高總抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)的活力[19]。然而,GSH通過食物途徑對海水養(yǎng)殖魚類的生長、生理代謝和飼料利用等方面的影響,還沒有相關(guān)的報(bào)道。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我國重要的海水養(yǎng)殖品種之一,然而由于愛德華氏菌癥、淋巴囊腫病等頑固性疾病的日益嚴(yán)重,養(yǎng)殖成活率下降,給牙鲆養(yǎng)殖業(yè)造成極大的損失[20]。目前,牙鲆的基本營養(yǎng)需求已經(jīng)明確,那么怎樣通過營養(yǎng)途徑來提升養(yǎng)殖牙鲆的健康水平,提高牙鲆的產(chǎn)量和品質(zhì),已經(jīng)成為人們?nèi)找骊P(guān)注的焦點(diǎn)。本研究擬利用以酪蛋白和明膠為蛋白源配制的精制飼料,分析在飼料中添加不同濃度梯度的GSH對牙鲆生長和抗氧化能力影響,為GSH在牙鲆飼料中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

以酪蛋白、明膠為主要蛋白源,魚油為主要脂肪源,糊精為主要糖源配制等氮等能的精制飼料,基礎(chǔ)飼料配方和營養(yǎng)組成見表1。在基礎(chǔ)飼料中添加不同梯度的GSH,分別為:0、100、200、400、700和1100 mg·kg-1;飼料中GSH含量的實(shí)測值分別為:0、97.96、189.92、371.84、688.72和1 063.56 mg·kg-1。

制作飼料時(shí),先將各種飼料原料粉碎,過60目篩,逐級(jí)擴(kuò)大混合均勻后,先后加入油和水,用雙螺桿擠條機(jī)(華南理工大學(xué),F-26(Ⅱ)型)加工成型,37℃烘干,制成顆粒飼料,-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)組成Table 1 Ingredients and composition of the basal diet

1.2 飼養(yǎng)與管理

牙鲆幼魚購自山東省日照市良種示范基地,為當(dāng)年孵化的同一批魚苗,初質(zhì)量為(9.49±0.22)g,實(shí)驗(yàn)魚個(gè)體無病無傷,體質(zhì)健壯。飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)在中國海洋大學(xué)鰲山衛(wèi)實(shí)驗(yàn)基地流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行,每個(gè)水槽為1個(gè)養(yǎng)殖單位,容積為300 L,水流速度為1 L·min-1,水溫(17～25)℃,鹽度30±1,溶氧不低于6 mg·L-1, p H=7.6～8.3。

正式實(shí)驗(yàn)開始前,先用基礎(chǔ)飼料馴化2周,待牙鲆完全適應(yīng)精制飼料和養(yǎng)殖環(huán)境后,開始隨機(jī)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共6個(gè)處理,每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)放魚30尾。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)持續(xù)8周,實(shí)驗(yàn)期間自然光照,每天投喂2次(08··00和18··00)。

1.3 樣品采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束前,牙鲆禁食24 h后稱質(zhì)量和計(jì)數(shù)。每個(gè)重復(fù)(水槽)隨機(jī)取8尾牙鲆,解剖采集肝臟,液氮速凍后-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

牙鲆的生長情況用增重率(WGR)來表示,其計(jì)算公式如下:

式中,Wt-終體質(zhì)量(g);Wi-初始體質(zhì)量(g)

1.4 樣品測定

將肝臟組織解凍,取采集到的8尾魚肝臟在預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(mg/μL=1/9)中勻漿混合均勻,4℃下3 500 r/min離心15 min,取上清,進(jìn)行指標(biāo)測定。

組織勻漿液的總蛋白測定使用南京建成生物工程研究所蛋白試劑盒,以考馬斯亮藍(lán)染色;GSH、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的測定采用南京建成生物工程研究所試劑盒,利用二硫代二硝基苯甲酸與巰基化合物的反應(yīng)比色測定;丙二醛(MDA)使用南京建成生物工程研究所試劑盒,根據(jù)硫代巴比妥酸法進(jìn)行比色定量測定;GST使用南京建成生物工程研究所試劑盒,利用GST催化GSH與1-氯-2,4-二硝基苯的結(jié)合能力的原理比色測定;SOD使用黃嘌呤氧化酶法測定,使用南京建成生物工程研究所試劑盒;T-AOC采用酶標(biāo)儀進(jìn)行比色定量測定,使用南京建成生物工程研究所試劑盒。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)處理得到的數(shù)據(jù)用單因素方差分析(ANOVA)。當(dāng)不同處理之間有顯著差異(P<0.05)時(shí),用Tukey檢驗(yàn)比較不同處理間的平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S.D.)表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 GSH對牙鲆增重率和成活率的影響

如表2所示,飼料中添加不同劑量的GSH對牙鲆幼魚的成活率沒有顯著影響(P>0.05),成活率在97.58%～100.00%范圍內(nèi)變動(dòng)。

GSH含量為371.84 mg·kg-1飼料組牙鲆的增重率在所有處理組中顯著最高(P<0.05),其值為118.81%±10.06%,其他各組間的增重率沒有顯著差異(P>0.05)。通過折線模型擬合,得知當(dāng)飼料中GSH含量為368.92 mg·kg-1時(shí),牙鲆增重率達(dá)到最大值116.34%(見圖1)。

表2 飼料中還原型谷胱甘肽(GSH)的不同水平對牙鲆增重率(WGR)和成活的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,n=31)Table 2 Effects of dietary reduced glutathione(GSH)on the weight gain rate(WGR)and survival of Paralichthys olivaceus(Mean±S.D.,n=31)

圖1 飼料中還原型谷胱甘肽(GSH)的不同水平對牙鲆增重率(WGR)的影響Fig.1 Effects of dietary reduced glutathione(GSH)on the weight gain rate(WGR)ofParalichthys olivaceus

2.2 GSH對牙鲆肝臟中GSH、MDA和T-AOC的影響

如表3所示,隨飼料中GSH含量的升高(0～1 063.56 mg·kg-1),肝臟GSH的含量有顯著的先升高后下降的趨勢。飼料中GSH含量為371.84 mg·kg-1時(shí),肝臟中的GSH含量最高,其值為(27.97±1.77)mg·g-1prot,顯著高于飼料GSH零添加組和1 063.56 mg· kg-1組(P<0.05)。

牙鲆肝臟中MDA水平隨著飼料中GSH添加量的升高呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,但各組間沒有顯著差異(P>0.05)。

表3 飼料中還原型谷胱甘肽(GSH)的不同水平對牙鲆肝臟GSH、丙二醛(MDA)和總抗氧化力(T-AOC)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,n=31)Table 3 Effects of dietary reduced glutathione(GSH)on the GSH,malondiadehyde(MDA)and the total antioxidative capacity(T-AOC)in hepatopancreas ofParalichthys olivaceus(Mean±S.D.,n=31)

隨著飼料中GSH含量的升高,肝臟中的T-AOC有先升高后降低的趨勢,且在飼料GSH含量為371.84 mg·kg-1時(shí)達(dá)到最高。各處理組T-AOC與對照組差異不顯著(P>0.05),但飼料GSH含量為371.84 mg·kg-1時(shí)的T-AOC顯著高于飼料GSH含量為1 063.56 mg·kg-1時(shí)的對應(yīng)值(P<0.05)。

2.3 GSH對牙鲆肝臟中GPx、GST、GR和SOD活力的影響

如表4所示,隨著飼料中GSH含量由0升高到1 063.56 mg·kg-1,肝臟中GPx活力有先上升后下降的趨勢,但各組間差異不顯著(P>0.05)。

GST活力與GPx的趨勢正好相反,有先下降后上升的趨勢,并在飼料GSH含量為371.84 mg·kg-1時(shí)達(dá)到最低,且顯著低于其它各組(P<0.05)。

肝臟GR活性除了在飼料GSH含量為1 063.56 mg·kg-1的處理組外,其它各組均顯著低于飼料GSH零添加組(P<0.05);飼料GSH含量為371.84 mg·kg-1時(shí), GR活力顯著低于其他各組(P<0.05)。

隨著飼料中GSH含量的升高,肝臟中的SOD活力有先升高后降低的趨勢,且在飼料GSH含量為371.84 mg·kg-1時(shí)達(dá)到最高。然而,肝臟中SOD的活力沒有受到飼料中GSH含量的顯著影響(P>0.05)。

表4 飼料中還原型谷胱甘肽(GSH)的不同水平對牙鲆肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、谷胱甘肽還原酶(GR)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,n=31)Table 4 Activities of Glutathione peroxidase(GPx),glutathione S-transferase(GST),glutathione reductase(GR)and the total superoxide dismutase(SOD)in hepatopancreas ofParalichthys olivaceusat different dietary reduced glutathione(GSH)levels(Mean±S.D.,n=31)

3 討論

谷胱甘肽系統(tǒng)主要是指GSH、GPx、GST和GR。GSH可以在GPx和GST的催化下清除機(jī)體內(nèi)H2O2和脂類過氧化過程的中間產(chǎn)物L(fēng)OO-或LOOH、防止血紅蛋白中的二價(jià)鐵氧化[21]和清除各種高活性自由基[22],在此過程中GSH本身被氧化生成GSSG;而GSSG可以在GR的催化下,以NADPH為供氫體還原為GSH。當(dāng)GSSG不能被及時(shí)還原為GSH的時(shí)候,GSH/GSSG的比值就要發(fā)生變化,這個(gè)比例的變化,可能是機(jī)體內(nèi)一些含有巰基和二硫鍵的酶活性發(fā)生改變,因此谷胱甘肽在GSH和GSSG狀態(tài)之間的相互轉(zhuǎn)化,對于維持機(jī)體的正常生理狀態(tài)十分重要[1-2]。

飼料中缺硒會(huì)導(dǎo)致虹鱒體內(nèi)GPx的活性顯著降低,同時(shí)GST活性顯著上升[23]。這表明GST在魚類體內(nèi)可以在GPx活性降低情況下作為1個(gè)抵抗氧化損傷的保護(hù)性機(jī)制而存在。此外,GST可以作為反映肝臟損傷的1種敏感指標(biāo),當(dāng)機(jī)體受到重金屬等氧化損傷時(shí),GST水平變化顯著[24]。在本研究中,牙鲆肝臟GSH積累量顯著受到飼料中不同水平GSH的影響,在飼料GSH含量為371.84 mg·kg-1時(shí),肝臟GSH積累量最大,且肝臟中GSH的沉積量與T-AOC變化趨勢一致,表明了肝臟中GSH的沉積可以提高機(jī)體總抗氧化能力。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中GPx和GST活力變化趨勢,表明飼料中適當(dāng)添加GSH在一定范圍內(nèi)可以促進(jìn)牙鲆的抗氧化機(jī)能發(fā)揮作用。然而,當(dāng)飼料中GSH的含量超過一定水平時(shí)(>371.84 mg·kg-1),牙鲆肝臟中GSH的沉積量下降,GPx活力降低,GST活力上升,與劉曉華等[17]在凡納濱對蝦中的研究結(jié)果相似,這可能是由于過量的GSH對機(jī)體抗氧化能力產(chǎn)生的負(fù)面影響[25-27]。本研究中GSH在肝臟中積累量增大時(shí),GR活性水平相應(yīng)降低,GR在機(jī)體內(nèi)主要是用以維持GSH/GSSG的平衡,這表明體內(nèi)GSH還原狀態(tài)的維持可以由外源GSH來輔助調(diào)節(jié),而不一定完全由內(nèi)源性GSSG轉(zhuǎn)化而來。

MDA作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物會(huì)對機(jī)體造成氧化脅迫和細(xì)胞損傷[27]。隨著飼料中GSH含量的升高,牙鲆肝臟中MDA含量有總體下降的趨勢(見表3),這表明飼料中添加適量的GSH能夠減少脂質(zhì)過氧化作用,保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷。大量研究表明,GSH在體內(nèi)的含量變化會(huì)保護(hù)蛋白巰基免受氧化損傷[28],在GPx的作用下催化各種親電子化合物反應(yīng),生成無毒性或者毒性小的化合物,以解除有毒物質(zhì)在體內(nèi)的積累[8,29-30],GSH在體內(nèi)的積累能夠提高機(jī)體清除自由基的能力、提高抗氧化力[19]。本實(shí)驗(yàn)中隨著飼料GSH含量由0增加到371.84 mg·kg-1時(shí),肝臟T-AOC和GPx活力逐漸升高。GPx作為機(jī)體抗氧化酶系的重要組成部分,間接反映了機(jī)體自由基反應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化和抗氧化能力[31-32],本實(shí)驗(yàn)中GPx活性的升高表明GSH能夠提高機(jī)體清除有害過氧化物的能力,同時(shí)T-AOC的升高也再次證明飼料中添加適量的GSH能夠提高牙鲆的抗氧化能力。然而,Thomas等[25]在分子細(xì)胞學(xué)水平的研究表明,GSH作為氧化物的前體,濃度過高時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒性,從而引起DNA損傷。Sah等[26]和高姝娟等[27]的研究發(fā)現(xiàn),過量的GSH與其它抗氧化劑一樣,會(huì)引起氧分子生成超氧陰離子。本研究的結(jié)果也表明,飼料中GSH的含量超過371.84 mg·kg-1后,會(huì)引起牙鲆肝臟中GSH的含量降低(見表3)、T-AOC下降(見表3)、GPx活性下降(見表4)和MDA含量升高(見表3),造成抗氧化能力下降,氧化脅迫升高。

飼料中適當(dāng)添加GSH能夠顯著促進(jìn)牙鲆的生長,這與在草魚[13]和凡納濱對蝦[17]中的研究結(jié)果一致。但對于牙鲆來說,GSH在飼料中的適宜含量為368.92 mg·kg-1,略高于草魚飼料中的適宜添加量300 mg·kg-1[13]。在對凡納濱對蝦[17]和草魚[13]的研究中表明,飼料中適量添加GSH可以通過提高胰島素樣生長因子IGF-1的水平而促進(jìn)動(dòng)物的生長。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸形成的三肽化合物,其中半胱氨酸脫羧產(chǎn)物半胱胺是輔酶A的組成成分,能夠破壞生長抑素分子的二硫鍵,使生長抑素的生物學(xué)功能可逆性喪失,解除生長抑素對生長激素等激素的抑制,促進(jìn)生長激素的分泌,從而起到促生長的作用,并在鰻魚[33]和草魚[34]的相關(guān)研究中得到了證實(shí)。另外,GSH能夠在動(dòng)物腸腔中起到保護(hù)腸黏膜免受毒物和過氧化物的損傷作用[35],從而保護(hù)動(dòng)物消化系統(tǒng)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中GSH能夠?qū)ρ丽铱寡趸瘷C(jī)能產(chǎn)生的積極影響,GSH對牙鲆生長的調(diào)節(jié)作用可能是綜合性的,相關(guān)機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

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Abstract: The basal diet employed casein and gelatin as main protein sources and was supplemented with reduced glutathione(GSH)up to 0,97.96,189.92,371.84,688.72 and 1 063.56 mg·kg-1diet.In the flowthrough culture system,the Japanese floundersParalichthys olivaceus(initial weight(9.49±0.22)g) were fed with graded levels of dietary GSH,respectively,for 8 weeks to evaluate their growth and antioxidative status.The results showed that survival rate was not significantly affected by dietary GSH levels(P>0.05).The average weight gain rate(WGR)in the treatment with 371.84 mg·kg-1dietary GSH was significantly higher than those in other treatments(P<0.05).The hepatic GSH concentration in dietary GSH added groups was significantly higher than that in dietary GSH deprived group(control group)(P<0.05).No significant differences in hepatic malondiadehyde(MDA)concentration were found between GSH deprived and supplemented groups(P>0.05).The lowest value of hepatic GR activities was found in treatment with 371.84 mg·kg-1dietary GSH(P<0.05).There were no significant differences in the activities of hepatic superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase(GPx)among the all treatments(P>0.05).In the group with 371.84 mg·kg-1dietary GSH,the total anti-oxidative capability(T-AOC)was significantly higher than that in the group with 1 063.56 mg·kg-1dietary GSH,however,the GST activity was significantly lower than those in the other groups(P<0.05). Based on the WGR data in the present experiment,a broken-line model was employed to calculate the optimal levels of dietary GSH,which was 368.92 mg·kg-1diet.Deficient or overdose of dietary GSH could cause negative effects on the growth and anti-oxidative capacity ofParalichthys olivaceus.

Key words: Paralichthys olivaceus;feeds;glutathione;growth;anti-oxidative capability

責(zé)任編輯 于 衛(wèi)

Effects of Dietary Reduced Glutathione on Growth and Anti-Oxidative Capability of Japanese Flounder,Paralichthys olivaceus

WANG Fang-Qian,ZHANG Wen-Bing,MAI Kang-Sen,XU Wei,WANG Xiao-Jie,LIUFU Zhi-Guo
(Key Laboratory of Mariculture,Ministry of Education,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

S963

A

1672-5174(2011)04-051-06

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA09Z437)資助

2010-01-07;

2010-04-27

王芳倩(1984-),女,碩士生。E-mail:wangfq-2007@163.com

E-mail:wzhang@ouc.edu.cn