抗原刺激后小鼠CD4+T細(xì)胞IL－10受體Ⅰ表達(dá)情況的研究

楊芳莉，刁騁，韋星呈，曾艷，嚴(yán)丹丹

(沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110034)

白細(xì)胞介素10(interleutin－10，IL－10) 是由 T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子［1－2］。也有研究指出調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞 (Treg)才是體內(nèi)IL－10的主要來源［3］。人類和小鼠的 IL－10 受體 (interleutin－10 receptor，IL－10R) 由 IL－10R1 和 IL－10R2 兩個(gè)亞單位組成。IL－10R2 不與 IL－10 發(fā)生結(jié)合，IL－10R1是IL－10R中與IL－10結(jié)合的亞單位，人類T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)較高水平IL－10R1［4］，活化后的T細(xì)胞IL－10R1表達(dá)水平有所下調(diào)［5］。與人類不同的是，小鼠靜息 T淋巴細(xì)胞表面不表達(dá) IL－10R1［6］。國外有報(bào)道指出小鼠CD8+T淋巴細(xì)胞接受抗原刺激后IL－10R1在細(xì)胞表面可有短暫的表達(dá)［7］，但關(guān)于CD4+T淋巴細(xì)胞相關(guān)方面的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)對(duì)抗原刺激后小鼠 CD4+T淋巴細(xì)胞表面 IL－10R1表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，為進(jìn)一步研究IL－10相關(guān)免疫疾病的發(fā)病及進(jìn)展提供有力支持。

1材料與方法

1.1 材料 試劑：小鼠 anti－CD4－FITC標(biāo)記熒光抗和 anti－IL－10R1－PE 標(biāo)記熒光抗體均購自 Biolegend公司;anti－CD28 和 anti－CD3 抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司公司;RPMI－1640培養(yǎng)基和小牛血清購自GIBCO GRL公司;尼龍毛購自日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社 (WOKA)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)6～8周齡 C57BL/6小鼠 (雌性)10只購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾細(xì)胞懸液的制備 處死小鼠，無菌條件下分離脾臟，注射器沖洗脾臟，無菌冷紅細(xì)胞裂解液處理后，洗滌細(xì)胞。加入適量PBS，充分混勻細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107cell/ml。

1.2.2 尼龍毛去除B細(xì)胞 稱取尼龍毛100 mg，充分填塞于5 ml注射器針筒內(nèi)，用適量PBS平衡。將脾細(xì)胞懸液緩慢經(jīng)過尼龍毛，過濾兩次，將所得細(xì)胞重新調(diào)整濃度至1×106cell/ml。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)無菌分選CD4+T淋巴細(xì)胞加入 anti－CD4－FITC 標(biāo)記抗體 1 μg/L × 106cells，室溫避光孵育30 min，500 r/min，離心5 min，清洗兩次后，500 μl PBS重懸細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀無菌分選，收集得到的CD4+T細(xì)胞，用加有10%小牛血清的RPMI－1640調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106cell/ml。將細(xì)胞放置于24孔培養(yǎng)板中無菌培養(yǎng)，1×105cell/孔。

1.2.4 抗原刺激 向各孔中分別加入 anti－CD3(1：200)和anti－CD28(1：200)多克隆抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激，并且無菌培養(yǎng)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IL－10R1表達(dá)情況 抗原刺激后0 h，12 h，24 h，48 h，72 h分別收集細(xì)胞，無菌PBS清洗，1 500 r/min，離心5 min。將細(xì)胞重懸于100 μl PBS中，輕彈起細(xì)胞，加入anti－IL－10R1－PE 抗體 0.2 μg/L × 106cells，室溫避光孵育30 min，500 r/min，離心5 min，清洗兩次后，500 μl PBS重懸細(xì)胞。以未加任何抗體的細(xì)胞做空白對(duì)照。流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞表面IL－10R1表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)無菌分選CD4+T淋巴細(xì)胞結(jié)果(圖1) 從圖1可見大量CD4+T淋巴細(xì)胞被選出，符合進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)分選CD4+T淋巴細(xì)胞結(jié)果圖(方框中為分選出的CD4+T淋巴細(xì)胞)

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)刺激各個(gè)時(shí)段CD4+T淋巴細(xì)胞IL－10R1表達(dá)情況 (圖2) 從圖2可見，0 h時(shí)CD4+T淋巴細(xì)胞幾乎不表達(dá)IL－10R1，12 h時(shí)IL－10R1表達(dá)上升，24 h時(shí)達(dá)到高峰，48 h時(shí)IL－10R1表達(dá)開始下降，72 h時(shí)表達(dá)水平與0 h接近。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)刺激各個(gè)時(shí)段CD4+T淋巴細(xì)胞IL－10R1表達(dá)水平結(jié)果圖

3 討論

本研究中，小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞未接受抗原刺激時(shí)不表達(dá)IL－10R1，因此不能與IL－10結(jié)合并接受IL－10對(duì)細(xì)胞的調(diào)控。但是這種來源于IL－10的免疫調(diào)控作用在小鼠體內(nèi)對(duì)T淋巴細(xì)胞并非無效，在抗原刺激后，小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞開始逐漸表達(dá)IL－10R1，在24 h時(shí)達(dá)到頂峰，隨后受體的表達(dá)水平開始下降，在72 h后恢復(fù)到未接受抗原刺激時(shí) (0 h的水平)。可見在小鼠體內(nèi)，IL－10作為一種重要的免疫抑制性調(diào)節(jié)因子，并不是始終直接對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用，這種直接的調(diào)節(jié)作用很可能體現(xiàn)在CD4+T淋巴細(xì)胞接受抗原刺激表達(dá)IL－10R1的短暫時(shí)間段內(nèi);在這個(gè)時(shí)間段內(nèi)，IL－10也很有可能參與了CD4+T淋巴細(xì)胞的分化過程。與小鼠不同的是，人類CD4+T淋巴細(xì)胞在未接受抗原刺激時(shí)就表達(dá)高水平的 IL－10R1［4］，在接受抗原刺激后 IL－10R1 的表達(dá)水平有所下降。也有研究指出活化后的單核巨噬細(xì)胞IL－10R1 表達(dá)水平上調(diào)［5］，這提示在人類 IL－10 直接對(duì)T淋巴細(xì)胞的抑制作用隨著活化是逐漸減弱，通過對(duì)抗原提呈細(xì)胞的抑制來間接對(duì)活化的T淋巴細(xì)胞起到很好的調(diào)控作用?？傊?，IL－10在小鼠體內(nèi)和人類體內(nèi)都對(duì)活化后的CD4+T淋巴細(xì)胞起到直接的調(diào)節(jié)作用，因此可以在模型小鼠身上研究在IL－10R1表達(dá)這一時(shí)間段內(nèi) IL－10對(duì) CD4+T淋巴細(xì)胞直接作用，為進(jìn)一步探討在人體中IL－10對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞的作用提供強(qiáng)有力的幫助，從而對(duì)進(jìn)一步揭示相關(guān)的自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制和疾病進(jìn)展情況，尋找治療新靶點(diǎn)具有重要意義。

目前，IL－10基因作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (systemic lupus erythematosus，SLE)遺傳候選基因，成為研究SLE發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)，同時(shí)也因其免疫抑制功能而成為研究其他自身免疫病發(fā)病機(jī)制的重要靶點(diǎn)。有人發(fā)現(xiàn)小鼠IL－10對(duì)小鼠B淋巴細(xì)胞的作用，在小鼠IL－10R1分子胞漿區(qū)呈區(qū)段分布，且靠近細(xì)胞膜的一段區(qū)域與抑制性調(diào)節(jié)有關(guān)［8］。還有人指出NZW狼瘡小鼠的IL－10R1基因在此區(qū)段具有突變，并且導(dǎo)致編碼氨基酸發(fā)生改變，這有可能使IL－10的免疫抑制功能受到影響，成為狼瘡發(fā)病的原因［6］。IL－10作為體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，進(jìn)一步研究自身免疫病小鼠模型中IL－10通過IL－10R1對(duì)T淋巴細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，對(duì)揭示自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制和指導(dǎo)臨床治療有重要意義。

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