辣椒基因組DNA不同提取方法的比較研究

蓬桂華，詹永發(fā)，蘇丹，何建文

（貴州省辣椒研究所，貴州遵義，563006）

辣椒以其特有的色澤、辣味、香味和豐富的維生素C而成為一種世界性的蔬菜作物，它既可鮮食、調(diào)味，也可入藥，是提煉辣椒油、辣椒紅素和辣椒素的原料，具有重要的經(jīng)濟價值和食療保健作用[1]。

近年來，辣椒分子領(lǐng)域的研究逐步成為國內(nèi)外研究的熱點，而提取高質(zhì)量的DNA分子是分子研究的基礎。目前，常用的的DNA提取方法主要有十六烷基三乙基溴化銨 （CTAB）法、十二烷基硫酸鈉（SDS）法和高鹽低pH法[2]。其中，SDS法操作簡單、溫和，并可提取到較高分子量DNA，但所得產(chǎn)物含糖類雜質(zhì)較多，這將直接影響DNA的限制性核酸內(nèi)切酶酶切效果；CTAB可破碎細胞壁和細胞膜，并能與核酸形成復合物，再加入乙醇后可使核酸沉淀，而CTAB則溶于乙醇，進而從富含多酚和多糖的植物組織中分離出高質(zhì)量基因組DNA[3]；高鹽低pH法可有效地防止組織破碎和沉淀大量材料時的電離化作用及酚類化合物的進一步氧化[4]，但高鹽低pH法提取DNA產(chǎn)率較低，且殘留的較多小分子鹽也會影響分子生物學試驗結(jié)果[2]。由于不同材料所含的物質(zhì)成分及各種成分的含量差異較大，而這種差異隨植物種類、植物組織或植物組織的發(fā)育階段等的不同而變化，因此，對于不同植物DNA提取應采取不同的方法[5]。

本研究采用改良CTAB法和SDS法分別提取辣椒基因組DNA，并對這2種方法進行比較分析，旨在篩選出一種快速、簡便且可獲得高質(zhì)量DNA分子的提取方法，為進一步開展辣椒分子生物學研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為辣椒種子A和B，均由貴州省辣椒研究所提供。將2層濾紙放入培養(yǎng)皿構(gòu)成發(fā)芽苗床進行辣椒種子發(fā)芽，期間用Hoagland's營養(yǎng)液澆灌，待幼苗長出2～3片真葉時，取幼嫩植株。

供試儀器有高速冷凍離心機（Benkman），恒溫水槽，水平電泳儀 （DYY-7C），核酸蛋白分析儀（Gene Quit 1300），全自動凝膠系統(tǒng)。

供試試劑有 EDTA、NaCl、CTAB、巰基乙醇、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇、SDS、β-巰基乙醇、醋酸鉀、瓊脂糖。

1.2 試驗方法

①改良的CTAB法 按照提取植物DNA的經(jīng)典方法加以改良來提取辣椒DNA：取0.1 g新鮮辣椒幼嫩植株，置于研缽中，加入700 μL 2%的CTAB提取液磨樣，轉(zhuǎn)入1.5 mL的離心管中；65℃水浴30 min（期間取出振蕩2次）；取出冷卻至室溫，加等體積的氯仿/異戊醇（24∶1），搖床上（130～140 r/min）搖至乳白色；4 000 r/min離心10 min；取出上清液至另一支1.5 mL離心管，加入0.8倍體積的異丙醇（-20℃下預冷）沉淀 DNA，靜置或輕搖；8 000 r/min離心 2 min，棄掉上清液；加1 mL 70%乙醇（-20℃下預冷）洗滌；8 000 r/min離心2 min，倒掉乙醇，自然干燥至無乙醇味；加200 μL超純水4℃下溶解；-20℃保存。

②SDS法 取0.1 g新鮮辣椒幼嫩植株，置于研缽中，加入700 μL的SDS提取液磨樣，轉(zhuǎn)入1.5 mL的離心管中；65℃水浴30 min（期間取出振蕩2次）；取出冷卻至室溫，加入250 μL醋酸鉀冰上震蕩20 min，4 000 r/min離心10 min；取出上清液至另一支1.5 mL離心管，加入0.8倍體積的異丙醇（-20℃下預冷）沉淀 DNA，靜置或輕搖；8 000 r/min離心2 min，棄掉上清液；加1 mL 70%乙醇（-20℃下預冷）洗滌；8 000 r/min離心2 min，倒掉乙醇，自然干燥至無乙醇味；加200 μL超純水4℃下溶解；-20℃保存。

③基因組DNA樣品的濃度檢測 利用核酸蛋白分析儀檢測所提取DNA樣品的濃度和質(zhì)量，并根據(jù)A260/A280值判斷DNA樣品的純度。純DNA樣品的 A260/A280值應為 1.8～1.9，A260/A230值應大于2.0。A260/A280值大于1.9時，表明有RNA污染；小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚類物質(zhì)污染。A260/A230值小于2.0時，表明溶液中有殘存鹽和小分子雜質(zhì)，如核甘酸、氨基酸、酚等[6]。

④基因組DNA樣品瓊脂糖凝膠電泳檢測 用1%的瓊脂糖凝膠電泳及godview染色，檢測提取基因組DNA質(zhì)量，然后用凝膠成像系統(tǒng)觀察、成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取方法的結(jié)果比較

由表1可以看出，CTAB法提取的辣椒基因組DNA A260/A280的比值為1.87～1.88，大于1.6，小于1.9，說明所提取DNA樣品中沒有蛋白質(zhì)污染；SDS法提取的A260/A280的比值大于1.9，說明提取DNA樣品中含有RNA，DNA純度不高。CTAB法和SDS法的A260/A230值均大于2.0，說明2種方法都能較好地去除酚類物質(zhì)及小分子鹽。另外，從DNA的濃度上看出，SDS法的產(chǎn)率最高，是CTAB法的2倍多。通過兩個品種的比較，2種方法在2個品種上的差異較小，表明2種方法對辣椒品種選擇沒有特殊要求，能用于不同辣椒品種的DNA提取。

表1 辣椒基因組DNA提取方法檢測結(jié)果

2.2 兩種方法提取辣椒基因組DNA的電泳檢測結(jié)果

圖1所示，對2種方法提取的辣椒幼苗的基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果表明，2種方法提取的DNA均有一條單一的信號強的主帶，點樣孔無亮點，說明沒有多糖等雜質(zhì)的污染。CTAB法（1～3道和7～9道）提取的DNA條帶均勻一致，拖尾彌散現(xiàn)象很少，說明DNA純度較高，無RNA污染；SDS 法（4～6 道、10～12 道）提取的 DNA 條帶出現(xiàn)嚴重拖尾彌散等現(xiàn)象，說明DNA發(fā)生部分降解，但SDS法的條帶較CTAB法的條帶大，說明SDS法的產(chǎn)率較CTAB法的高。另外，2種方法在不同的品種上表現(xiàn)較為一致，說明這2種方法都適用于不同品種辣椒DNA的提取。

圖1 辣椒基因組DNA提取凝膠電泳檢測

3 小結(jié)與討論

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，快速、經(jīng)濟、安全、高效地提取辣椒基因組DNA為其在資源鑒定、遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系評估、分子標記輔助選擇等方面奠定基礎。辣椒葉片中富含的酚類物質(zhì)不僅可導致DNA降解，與DNA結(jié)合形成黃色至黑褐色的難以溶解的沉淀物，還可使提取液顏色變深，因此很難得到高純度DNA。本研究通過應用改良的CTAB法提取的辣椒基因組DNA，經(jīng)分析其A260/A280的比值為1.87～1.88，樣品DNA的純度較高，不含蛋白質(zhì)、RNA等雜質(zhì)。而應用SDS法提取的辣椒基因組DNA A260/A280的比值大于1.9，提取的DNA純度不高，并出現(xiàn)DNA降解現(xiàn)象，但SDS法提取的辣椒基因組DNA的產(chǎn)率比CTAB法的高。與石慶華等[8]通過對刺山柑的研究指出，CTAB法提取DNA的A260/A280的比值大于1.8，而SDS法的為1.65左右，李娟玲等[9]通過改良CTAB法提取鷓鴣茶基因組DNA的A260/A280的比值在1.8左右的研究結(jié)果相一致。另外，還有研究認為，CTAB法在香蕉[10]、大花萱草[11]、蘋果[12]上提取DNA的純度高于SDS法。

本研究結(jié)果表明，通過改良的CTAB法和SDS法都能提取出辣椒的總DNA。改良CTAB法提取的辣椒基因組DNA質(zhì)量高于SDS，但SDS法提取的量大于CTAB法，研究者可以根據(jù)自己的試驗要求合理選擇適合的提取方法。

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