大鼠30%小體積肝移植模型兩種切肝方法的比較

宋 軍，丁志龍，徐 為，李文美，李向農(nóng)，王學(xué)浩

(1徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，江蘇 徐州 221002;2南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

近年來，供肝短缺促使活體肝移植在臨床上得到廣泛的開展。然而供肝體積的減少導(dǎo)致移植后肝臟的功能不全和相關(guān)并發(fā)癥也相應(yīng)增加，其確切的機制尚不明確［1，2］。為研究其機制及有效的干預(yù)措施，建立與臨床相似的小肝移植動物模型成為該研究的基礎(chǔ)［3］。我們以 Kamada等［4］的“二袖套法”非動脈化大鼠原位肝移植模型為基礎(chǔ)，以體內(nèi)切肝法切取供肝，并進行技術(shù)改進，對選取不同切肝方法的術(shù)后生存率及并發(fā)癥進行觀察，從而建立更穩(wěn)定的大鼠小體積肝移植模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及器材 清潔級成年雄性SD大鼠160只，徐州醫(yī)學(xué)院動物中心提供，體質(zhì)量250～300 g，供體體質(zhì)量略低于受體(約低10～30 g)，分為兩組。術(shù)前自由進食飲水。顯微外科手術(shù)器械1套(上海醫(yī)療器械有限公司)，自制門靜脈與下腔靜脈套管(6F～8F動脈穿刺套管外鞘制成)、膽管支架(硬膜外導(dǎo)管拉制而成)、6-0無損傷縫合線(上海醫(yī)用縫合線廠)。

1.2 供肝的獲取 戊巴比妥45 mg/kg腹腔注射麻醉。共同步驟如下:麻醉成功后，固定、備皮、消毒、“大十字”切口進腹。暴露右腰靜脈，經(jīng)右腰靜脈注入100 U肝素，使供體“肝素化”，血管夾夾閉。游離肝鐮狀韌帶、左右冠狀韌帶、縫扎左膈下靜脈;游離膽總管，于膽總管前壁距膽總管分叉約4 mm處做一斜切口，插入硬膜外導(dǎo)管制成的膽管支架(長約5 mm，內(nèi)口位于膽總管分叉處1～2 mm)、5-0絲線結(jié)扎固定，并留一線頭備用、剪斷遠端膽總管。游離門靜脈，于根部用6-0無損傷線結(jié)扎(不可太靠近門靜脈，以免門靜脈狹窄)，于線結(jié)處剪斷，盡可能不留線頭，防止套管時刺破門靜脈;解剖下腔靜脈，游離右腎靜脈;分離結(jié)扎切斷右腎上腺靜脈，將肝臟向左側(cè)翻，迅速離斷肝右側(cè)后的韌帶，結(jié)扎切斷肝食管支及肝左葉的韌帶，至此兩組供肝的共同步驟完成。下面是不同組的切肝步驟:A組:于肝中葉和下方三葉交界的第一肝門處5-0結(jié)扎(注意不可結(jié)扎下方的膽管分叉處)，5-0絲線結(jié)扎左葉根部并切除肝左葉。于肝中葉上方肝上下腔靜脈與肝靜脈的分叉處上方平行于肝上下腔靜脈穿過肝中葉至肝中葉分叉處(其間一旦遇到阻力便重新穿過，不可硬捅)帶兩根5-0絲線，分別結(jié)扎肝中葉兩側(cè)。結(jié)扎右側(cè)時先用顯微鑷在肝上下腔靜脈前方鉗夾部分肝組織，再打結(jié)，切除肝中葉。至此，在體剩余肝臟(肝右葉、尾狀葉和三角葉)即為30%小體積供肝。B組:5-0絲線直接自蒂部結(jié)扎切除尾葉，6-0無損傷縫線縫扎、切除肝左葉，6-0絲線自根部結(jié)扎三角葉(注意勿太靠近肝下下腔靜脈)，右葉的切除方法采取6-0無損傷縫線先縫扎部分右葉，5-0絲線結(jié)扎剩余的肝右葉。至此，剩余肝臟(中葉)即為30%小體積供肝。下面仍是相同步驟:于髂動脈分支平面用血管鉗阻斷腹主動脈，穿刺腹主動脈;剪開膈肌，夾閉胸主動脈;平左腎靜脈剪斷下腔靜脈，立即行原位灌注(灌注液為0～4℃的林格氏液，調(diào)整液面高度為60～70 cm)，待肝臟變白后，下拉肝臟迅速剪開膈肌，保留膈肌環(huán)，切斷胸段肝上下腔靜脈。于結(jié)扎線外側(cè)切斷右腎上腺和右腎靜脈，游離門靜脈，緊貼門靜脈結(jié)扎切斷幽門靜脈。于脾靜脈水平剪斷門靜脈，分離門靜脈周圍結(jié)締組織。肝動脈無需結(jié)扎，直接剪斷。取出肝臟置于0～4℃的冰水中。

1.3 供肝準(zhǔn)備 本步驟在冰水中進行，肝上下腔靜脈修剪后，剔除門靜脈、下腔靜脈壁周圍的結(jié)締組織;將門靜脈、下腔靜脈分別套入套管中并用6-0絲線結(jié)扎。在肝上下腔靜脈兩側(cè)用6-0無損傷縫合線做牽引。供肝準(zhǔn)備妥當(dāng)，4℃肝素乳酸林格氏液中保存。

1.4 供肝植入 鹽酸氯胺酮(100 mg/kg)腹腔注射麻醉成功后，固定、備皮、消毒，腹正中切口進腹，游離肝臟，縫扎左膈靜脈。分離膽總管，結(jié)扎留一線頭切斷膽總管。游離下腔靜脈，結(jié)扎右腎上腺靜脈，迅速剪斷肝后韌帶，結(jié)扎切斷肝食管交通支。游離結(jié)扎切斷肝動脈。血管夾夾住門靜脈，無肝期開始。經(jīng)門靜脈注入林格液1.5 ml，以驅(qū)出肝內(nèi)血液，血管夾夾住下腔靜脈，并切斷。用Satinsky鉗連帶少許膈肌夾住肝上下腔靜脈，移除肝臟。將供肝放于肝床上的紗布上，單層連續(xù)吻合肝上下腔靜脈(縫閉前壁前注意要用肝素水排氣)。套入門靜脈并結(jié)扎固定，開放門靜脈和取出Satinsky鉗，無肝期結(jié)束。套入下腔靜脈并結(jié)扎固定，開放下腔靜脈。套門靜脈和下腔靜脈前要開放血管夾放血少量，以沖出血凝塊。將受體膽總管套入膽總管支架內(nèi)，結(jié)扎固定。清理腹腔后關(guān)腹，大鼠單籠飼養(yǎng)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，切肝時間的比較用t檢驗，肝后下腔狹窄和術(shù)后3 d生存率的比較用χ2檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

手術(shù)并發(fā)癥及術(shù)后生存率見表1。

表1 小體積肝移植模型兩種切肝方法術(shù)后并發(fā)癥及3 d生存率的比較

3 討論

隨著活體肝移植在臨床上的推廣和應(yīng)用，探討小肝綜合癥的發(fā)生機制和干預(yù)措施已經(jīng)成為肝移植研究領(lǐng)域的又一熱點［5］。建立理想的小體積肝移植動物模型是開展這些研究的基礎(chǔ)。根據(jù)研究的不同需要，切除相應(yīng)的肝葉而得到不同體積的肝移植模型，一般50%以下的大鼠肝移植為小體積肝移植，30%以下為超小肝移植模型。據(jù)文獻報道，30%大鼠肝移植模型建立時供肝主要有以下3種:中葉、右中葉+右葉、右葉+尾狀葉+三角葉［6］。中葉作為供肝的優(yōu)點是肝葉完整，無大的肝斷面，不易形成膽瘺和斷面滲血;缺點是切除左葉和右葉麻煩，易造成肝后下腔靜脈狹窄和血供障礙。右中葉+右葉作為供肝的優(yōu)點是左葉切除比較容易，省時省力;缺點是造成大的肝臟斷面，增加了膽瘺和斷面滲血的發(fā)生率。右葉+尾狀葉+三角葉供肝在以往的報道中應(yīng)用較少，主要原因可能是中葉根部包繞肝后下腔靜脈的前方和兩側(cè)，所以左葉切除比較費時，同時可能致下腔靜脈狹窄。切除肝左葉時亦可致切面滲血而增加手術(shù)并發(fā)癥。

本實驗做了以下改進:①于左葉、中葉和尾狀葉、右葉之間用5-0絲線結(jié)扎第一肝門，這樣阻斷了供應(yīng)左葉和中葉的血流，減少切除左葉、中葉后斷面滲血和膽瘺的可能。②分兩步結(jié)扎肝中葉，可有效避免結(jié)扎中葉時可能造成的肝下腔靜脈狹窄，從而突破了保留右葉+三角葉+尾狀葉作為供肝的技術(shù)要點;同時給吻合肝上下腔靜脈留下足夠的空間。本研究兩組術(shù)后成活率并無統(tǒng)計學(xué)差異，并且術(shù)后肝臟斷面出血、膽瘺的并發(fā)癥與中葉供肝并無差別，但在切肝時間上，其比中葉供肝短，肝后下腔靜脈狹窄的發(fā)生率降低。

總之，建立大鼠30%肝移植模型有多種供肝方法可供選擇，通過技術(shù)改進和切肝方式的改進，以右葉+三角葉+尾狀葉供肝的切肝方式可以建立穩(wěn)定的大鼠30%小肝移植模型。

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