推拿足三里、腎俞穴對陽虛模型大鼠外周血IL-2水平影響的實驗研究

430061 湖北中醫(yī)藥大學針灸骨傷學院 樊云 甘水詠

430000 湖北省武漢市第十一醫(yī)院 吳淼

430014 湖北省中山醫(yī)院 何生華

中醫(yī)學陽虛證的主要內在特征之一是機體免疫系統功能低下，外周血白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)水平是反映機體免疫系統功能狀況的重要指標。大量臨床實踐顯示，推拿療法防治免疫系統功能低下類疾病具有良好的效果。但目前國內對中醫(yī)藥防治免疫系統功能低下類疾病的實驗研究多集中在針灸、中藥等方面，本研究嘗試從穴位推拿的角度來探討推拿療法防治陽虛證的免疫學機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wister大鼠30只，6～7周齡，200～250 g[清潔級，湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號：SCXK(鄂)2003-0005]，雌雄兼用。

1.2 主要試劑 大鼠IL-2定量ELISA試劑盒由上海森雄科技實業(yè)有限公司提供；醋酸潑尼松注射液(AHP)：125 mg/5 mL，浙江仙琚制藥股份有限公司產品；黃芪注射液：20 g/10 mL，杭州正大青春寶藥業(yè)有限公司產品；質量濃度為0.009 g/mL的氯化鈉注射液，質量濃度為0.05 g/mL的葡萄糖注射液等。

1.3 主要儀器設備 XD711C型全自動酶標儀 (編號：01710318，上海迅達醫(yī)療儀器公司)、北京醫(yī)用離心機廠LD5-2A型離心機、武漢市自動儀表廠TCS-200A型電子秤(量制鄂字01000127)、試管震蕩器、電熱恒溫水箱、自制小型電動按摩治療儀等。

1.4 實驗過程

1.4.1 陽虛大鼠動物模型的建立 Wister大鼠每天每鼠按照3 mg/100 g體質量標準進行大腿肌肉注射AHP，連續(xù)5 d。大鼠出現拱背、蜷曲、肢尾冷、擠臥在一起、神疲、反應遲鈍、被毛疏松、失去光澤、消瘦、少食、腰膝酸軟(游泳存活時間縮短)、畏寒肢冷、精神不振、脫毛虛損狀[1]。根據中醫(yī)陽虛證辨證參考標準[2]，類似“陽虛”狀態(tài)。

1.4.2 實驗動物分組 將建立好的陽虛模型大鼠編號，根據隨機分組表，分為生理鹽水灌服對照組(A組)、黃芪注射液注射組(B組)、穴位推拿治療組(C組)，共3組，每組10只，雌雄分養(yǎng)。

1.4.3 實驗方法 A組大鼠每天每鼠用注射器灌服生理鹽水3 mL，1次/d，連續(xù)2周；B組大鼠每天每鼠按照1 g/100 g體質量在大腿肌肉注射黃芪注射液，1次/d，連續(xù)2周；C組大鼠每天每鼠用自制小型電動按摩治療儀在其足三里、腎俞兩穴進行定量推拿，2次/d，每次每穴10 min，連續(xù)2周。經過測量，自制小型電動按摩治療儀撞頭叩擊穴位的頻率為240次/min，相當于推拿手法中的振動類手法，叩擊穴位的力度為250 N/次。選穴：“足(后)三里”穴(雙)，定位于后肢脛骨粗隆外膝至踝間上1/5處[3]；“腎俞”穴，定位，首先用手觸摸到大鼠背部脊柱及兩旁的肋骨，在肋骨結束的水平，定位第十二胸椎，然后往下數二個棘突，左右旁開10 mm(同身寸，大約為人體的1/10)即為“腎俞”穴[4]。

1.4.4 觀察指標及檢測 ①采用大鼠眼球摘除取血法取被檢測大鼠新鮮全血2～3 mL，加入一次性EP管中。然后，各管中均加入50 μL 1%肝素鈉作為抗凝劑，立即用力搖晃EP管，以充分抗凝。②各EP管上離心機低速(500×g)離心5 min，取上清液備用。③取試劑盒中的20×洗滌液，用蒸餾水1∶20稀釋備用。④底物工作液配制：將大鼠IL-2定量ELISA試劑盒中的酶底物OPD片放入底物稀釋液中溶解，每片加液5 mL。⑤標準品液配制：使用前每管加入蒸餾水100 μL溶解后即可。⑥將大鼠IL-2定量ELA試劑盒中的96孔微孔板取8孔作為標準孔，每孔中各加入樣品稀釋液100 μL，第1孔加標準品100 μL，混勻后用加樣器吸出100 μL，移至第2孔。如此反復對倍稀釋至第7孔，最后，從第7孔中吸出100 μL棄去，使之體積均為100 μL。第8孔為空白對照。⑦加樣：在96孔板中取30孔作為待測品孔，每孔中加入待測大鼠新鮮全血離心后上清液100 μL。⑧將8孔標準孔板與30孔待測品孔板一起放置在反應板上，然后把反應板放入電熱恒溫水箱中37℃水浴120 min。⑨洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，向濾紙上印干。⑩每孔中加入第一抗體工作液50 μL。⑾將反應板放入電熱恒溫水箱中37℃水浴120 min。⑿洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，向濾紙上印干。⒀每孔中加入酶標抗體工作液100 μL。⒁將反應板放入電熱恒溫水箱中37℃水浴120 min。⒂洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，向濾紙上印干。⒃每孔加入底物工作液100 μL，置37℃暗處反應5～10 min。⒄每孔加入1滴終止液混勻。⒅把8孔標準孔板與30孔待測品孔板放入XD711C型全自動酶標儀中，將儀器項目名稱調到IL-2，類型調到定量，測量方式調到終點法，波長調到492 nm，震動調到否，標準值調到1∶0.00，儀器即開始自動檢測待測樣品IL-2的水平。

2 實驗結果及統計處理(表1)

所有計量資料結果用均數±標準差(x±s)表示，運用SPSS 11.1軟件進行統計學處理。

表1 各組陽虛大鼠實驗后外周血中IL-2水平(pmol/L)比較(±s)

表1 各組陽虛大鼠實驗后外周血中IL-2水平(pmol/L)比較(±s)

分組 n 指標讀數生理鹽水灌服對照組(A組) 10 0.101 3±0.008 58黃芪注射液注射組(B組) 10 0.112 4±0.004 16★穴位推拿治療組(C組) 10 0.113 4±0.004 70★▲

注：與A組比較，★P＜0.01，差異有高度統計學意義；與B組比較，▲P＞0.05，差異無統計學意義

3 討論

祖國醫(yī)學認為陽虛是由于陽氣偏衰、正氣不足、陰陽失調從而使機體呈現機能衰退、代謝活動減弱、熱量不足的病理狀態(tài)[1]。本實驗用免疫抑制劑AHP注射液造成的“陽虛”模型可見大鼠萎靡不振、毛色無光澤、弓背少動、反應遲鈍、腹瀉等現象，此模型與鄺氏等報道的一致[5]。研究顯示陽虛證與機體免疫功能低下有關，而IL-2水平是反映機體體液免疫功能狀況的重要指標。

IL-2在很多疾病的研究中不僅可以作為判斷病情輕重和機體免疫狀態(tài)的一個指標，也是目前國內外研究最為活躍、最清楚、最為廣泛的一種細胞因子，它具有顯著的免疫增強作用，不僅自身可促進T細胞增生分化和B細胞分泌抗體，增強NK細胞和CTL的殺傷力，還可與其他細胞因子如IFN-γ、TNF等一起發(fā)揮免疫功能[6]。從體液免疫角度看，IL-2在淋巴因子調節(jié)免疫反應的分枝網絡中處于中心地位。因此，IL-2在機體的免疫應答和免疫調節(jié)中具有重要意義[7]。

陽虛證如何治療？陽虛學說[8]認為治療陽虛證的原則當用溫補法?！鹅`樞·經脈篇》曰：“盛則瀉之，虛則補之?！薄端貑枴り庩枒蟠笳摗吩唬骸靶尾蛔阏?，溫之以氣；精不足者，補之以味?！敝嗅t(yī)臨床中常用的“扶正固本，補中益氣”經典代表藥物之一是黃芪。有研究[9-10]發(fā)現黃芪對IL-2有正向調節(jié)，促進分泌等作用。

中醫(yī)學認為“陽虛”的病變機制一般多以脾腎陽虛為主。針灸學中足三里穴是氣血“百川歸海”之穴，是足陽明胃經的下合穴，有補益后天之要功。五臟之中的“腎”被稱為“先天之本”。腎藏元氣，中醫(yī)理論的“正氣存內，邪不可干”，氣在人體有抵御各種病邪的功能，這與現代免疫學認為的免疫三大功能：防御、自穩(wěn)、監(jiān)視是相一致的?！端貑枴り庩枒蟠笳摗吩唬骸澳I生骨髓”，髓系腎之精氣所化生，能滋養(yǎng)骨骼。腎俞穴為腎之背俞，是腎之精氣聚集之處，為補腎之要穴。故本實驗選擇足三里、腎俞穴立論，并與黃芪進行對照。

我們的實驗結果顯示：陽虛模型大鼠經過足三里、腎俞穴量化推拿治療后，與生理鹽水灌服組比較，外周血中細胞因子IL-2水平明顯上升(P＜0.01)；陽虛模型大鼠經過黃芪注射液肌肉注射后，與生理鹽水灌服組比較，其外周血中細胞因子IL-2水平明顯上升(P＜0.01)；足三里、腎俞穴量化推拿治療法與黃芪注射液肌肉注射法在提高陽虛模型大鼠外周血細胞因子IL-2的水平方面差異均無統計學意義(P＞0.05)。由此可見，推拿足三里、腎俞穴，可以提高陽虛大鼠外周血IL-2水平，增強陽虛大鼠免疫能力。

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