TGF-β1對(duì)鈦表面成骨相關(guān)蛋白基因表達(dá)的影響*

鄭紀(jì)偉 韓斐斐 王 瑾 韓建國 丁志江

中國社會(huì)漸步入老齡化，牙體缺失情況越來越嚴(yán)重，隨著經(jīng)濟(jì)水平的增長及對(duì)美觀要求的提高，種植作為修復(fù)缺失牙的重要手段變得越來越重要。種植成功的關(guān)鍵在于形成良好的種植體-骨界面[1]，如何獲得這種理想的種植體-骨界面結(jié)合方式，影響因素主要有種植體、成骨細(xì)胞功能和其他外在因素等。外源性細(xì)胞因子對(duì)成骨細(xì)胞的功能具有重要的調(diào)節(jié)作用，TGF-β1就是其中一類重要的多肽類生長因子。鑒于TGF-β1對(duì)于成骨細(xì)胞作用的復(fù)雜性和多樣性，以及有關(guān)TGF-β1對(duì)接種于鈦片表面的成骨細(xì)胞作用的報(bào)道相對(duì)較少，本研究采用體外實(shí)驗(yàn)的方法，探討特定濃度的TGF-β1對(duì)鈦表面成骨細(xì)胞的增殖、分化的影響。

1. 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和主要儀器 MC3T3-E1成骨細(xì)胞系(ATCC中心，美國)；TGF-β1(Peprotech公司，英國)；GAPDH引物及其它引物均由上海生工合成(見表1)。

純鈦片(Strauman公司，瑞士)TA2，直徑15mm，厚約1mm，使用噴砂機(jī)用TiO2均勻噴砂處理3min，10%鹽酸處理1min，去離子水清洗，5%碳酸氫鈉中和，去離子水清洗三次，高溫高壓消毒備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及鈦片表面細(xì)胞接種 取出凍存的成骨細(xì)胞，置42℃水浴使其快速融化。轉(zhuǎn)移至離心管，磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline，PBS)沖洗，DMEM完全培養(yǎng)液重懸。轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，加入含10%胎牛血清的完全DMEM培養(yǎng)液，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長成單層后，倒掉瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，加少許消化液，靜置5～10分鐘。倒掉消化液，制成細(xì)胞懸液，送回二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將處理好的鈦片置于6孔培養(yǎng)板中，每孔六片，平鋪板底。取處對(duì)數(shù)生長期的成骨細(xì)胞，0.25%胰酶+0.02%EDTA消化，DMEM培養(yǎng)基混懸成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度1×105個(gè)/ml，取100ul滴種于鈦片表面，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4～6h后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液2ml，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，3d換液一次。

1.2.2 TGF-β刺激 實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入0.5ng/ml TGF-β1刺激細(xì)胞，對(duì)照組不加TGF-β1，采用酶消化法分別收集培養(yǎng)后1d，3d，7d后的細(xì)胞，每孔中六塊鈦板的細(xì)胞作為一個(gè)樣本，應(yīng)用RT-PCR檢測蛋白表達(dá)情況并做對(duì)比分析。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)(1)總RNA提取：采用TRlzol試劑盒，提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測定260nm和280nm處的OD值，檢測總RNA的純度，并做快速瓊脂糖電泳，分析RNA的完整性。(2)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。(3)以此為模板行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為10×PCR Buffer 5μl，25mmol/L MgCl23μl，10mmol/L dNTP 1μl ，Primer1 1μl，Primer2 1μl，cDNA 3μl，5U/μl Taq DNA polymerase 0.8μl， sterilized ddH2O 35.2μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min后，以92℃變性40秒，按照表1中所列出的最佳退火溫度退火45秒，72℃延伸1分40秒，為一個(gè)循環(huán)，共35個(gè)循環(huán)，最后再于72℃延伸15min。(每樣本重復(fù)三管)(4)產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳，并經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析。

表1 引物序列、產(chǎn)物大小及退火溫度

1.2.4 成像系統(tǒng)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 體外實(shí)驗(yàn)中基因的表達(dá)量與電泳條帶的亮度成正比，以GAPDH為內(nèi)參照，Gene Ruler100bpDNA Ladder為標(biāo)記，對(duì)電泳條帶進(jìn)行圖像光密度半定量分析，RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳，并經(jīng)成像系統(tǒng)分析后得到各個(gè)條帶的灰度值，用目的基因的灰度值比上內(nèi)參的灰度值就是這個(gè)基因相對(duì)表達(dá)的量，防止因細(xì)胞數(shù)目差異而造成誤差。測量和計(jì)算各組目的擴(kuò)增帶與內(nèi)參灰度值的比值，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較應(yīng)用方差分析和q檢驗(yàn)分析，P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性意義。

2. 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

成骨細(xì)胞鋪板后24h，大部分細(xì)胞貼壁，呈紡錘形，大部分細(xì)胞帶有突起，數(shù)目和長短不一，且形成分散的集落，大小不等，融合后呈復(fù)層生長（見圖1）。

2.2 TGF-β1刺激后OC、BSP、COL-I和內(nèi)參在不同培養(yǎng)時(shí)間的成骨細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)照情況(圖2-8，表2)

外源性TGF-β1加入后，對(duì)幾種細(xì)胞因子表達(dá)影響的相對(duì)半定量分析結(jié)果如表2。由圖2-圖7可以看出，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中OC、BSP和Col-I表達(dá)量均有顯著增加，且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組內(nèi)及組間比較P＜0.05，表達(dá)量變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖8為內(nèi)參在不同時(shí)間點(diǎn)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞中0.5ng/mlTGF-β刺激前后的表達(dá)對(duì)照情況，1-6泳道中均可見大小約250bp左右的電泳條帶，與設(shè)計(jì)的片段大小基本一致。凝膠成像系統(tǒng)光密度分析后可見各組內(nèi)參表達(dá)量基本一致。

表2 RT-PCR相對(duì)半定量分析TGF-β1刺激后體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞各個(gè)時(shí)間點(diǎn)三種細(xì)胞因子的表達(dá)結(jié)果(±s，n=9)

表2 RT-PCR相對(duì)半定量分析TGF-β1刺激后體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞各個(gè)時(shí)間點(diǎn)三種細(xì)胞因子的表達(dá)結(jié)果(±s，n=9)

注：每種蛋白各時(shí)間點(diǎn)之間比較，P＜0.05，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

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3.討論

種植體植入牙槽骨的機(jī)械創(chuàng)傷使周圍骨組織釋放大量生長因子，啟動(dòng)骨的修復(fù)，達(dá)到種植體周圍骨性融合。成骨細(xì)胞是骨改建過程中最重要的功能細(xì)胞，同時(shí)也是種植體-骨界面形成過程中最活躍的細(xì)胞之一，在這個(gè)過程中，多種生長因子通過刺激成骨細(xì)胞的增殖和活性，對(duì)種植體周圍骨的生長起著重要的調(diào)控作用。TGF-β1就是其中重要的多肽生長因子，它的應(yīng)用能夠有效的促進(jìn)種植體的骨整合，是目前所知的作用最為復(fù)雜和多樣的生長因子，參與調(diào)控組織修復(fù)和重建，并能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化[2-3]。本研究選用鈦片模擬種植體，通過體外構(gòu)建成骨細(xì)胞模型，加入特定濃度TGF-β1刺激細(xì)胞生長，利用RT-PCR的方法，檢測不同時(shí)間TGF-β1刺激后體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞中幾種蛋白因子的表達(dá)情況，探討TGF-β1對(duì)鈦片表面成骨細(xì)胞增殖分化的影響，為臨床種植體的設(shè)計(jì)和應(yīng)用提供相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞來自美國ATCC中心的MC3T3-E1成骨細(xì)胞系，可采用液氮冷凍等方式長期保存，經(jīng)多次傳代后其遺傳性質(zhì)及生物學(xué)特征均不發(fā)生變異，復(fù)蘇后的凍存細(xì)胞仍具有穩(wěn)定的生物學(xué)特征，因此可以為體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞進(jìn)行分析提供基礎(chǔ)。成骨細(xì)胞是骨發(fā)生和骨形成的重要細(xì)胞，具有合成、分泌組成骨基質(zhì)的膠原和糖蛋白的作用，并通過鈣化基質(zhì)形成骨組織。在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中的成骨細(xì)胞表型發(fā)育與其體內(nèi)發(fā)育分化有著較大的相似之處，通過酶消化法，成骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)的情況下，重演了體內(nèi)成骨細(xì)胞從細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)成熟到基質(zhì)礦化的整個(gè)過程，因而可作為一個(gè)良好的研究成骨細(xì)胞表型發(fā)育的體外模型系統(tǒng)。

鈦及鈦合金因具有優(yōu)良的生物相容性、機(jī)械性能、耐腐蝕性和較好的可加工性而成為目前臨床上應(yīng)用最廣泛的骨內(nèi)、牙植入材料。經(jīng)過適當(dāng)加工后的鈦片與成骨細(xì)胞有很好的組織相容性，能使成骨細(xì)胞貼附于鈦片表面，并在一定條件下影響成骨細(xì)胞的增殖和分化。以往對(duì)此的研究較少，所以復(fù)合鈦片后觀察對(duì)成骨細(xì)胞礦化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響有非常大的臨床意義。

TGF-β1對(duì)骨代謝的調(diào)節(jié)作用非常復(fù)雜，在不同條件下表現(xiàn)為促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖的雙重調(diào)節(jié)[4-6]。成骨細(xì)胞是骨組織中合成分泌TGF-β1的主要細(xì)胞，成骨細(xì)胞通過合成分泌TGF-β1，調(diào)節(jié)其自身增殖分化和代謝，從而調(diào)節(jié)骨代謝[7]。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)室得到了可產(chǎn)生不同影響的TGF-β1的大致濃度。本次實(shí)驗(yàn)中所選0.5ng/ml TGF-β1可以增強(qiáng)細(xì)胞的增殖活性，增加幾種礦化相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，這符合細(xì)胞因子在低濃度下起刺激作用，而在高濃度下起抑制作用的普遍規(guī)律[8]。

骨鈣素是反映成骨細(xì)胞分化成熟的指標(biāo)，它能準(zhǔn)確反映成骨細(xì)胞的成骨功能，本實(shí)驗(yàn)中選取TGF-βl為0.5ng/ml時(shí)，骨鈣素分泌量增多，細(xì)胞生長旺盛，這提示，0.5ng/ml TGF-β能促進(jìn)成骨細(xì)胞形成、活性增加。BSP是礦化組織特異性的，是礦化組織分化的晚期標(biāo)志。參與細(xì)胞粘附、細(xì)胞轉(zhuǎn)移和信號(hào)識(shí)別，作為骨細(xì)胞外基質(zhì)參與骨代謝。在成骨過程中它的主要作用是作為羥基磷灰石形成的初始核心，啟動(dòng)礦化過程，在礦化開始后刺激羥基磷灰石晶體的生長。BSP的表達(dá)局限于礦化組織，是礦化組織特異性的。膠原蛋白是骨組織的主要成份，以I型膠原蛋白為主。定向分化的成骨細(xì)胞增殖分化過程中，首先表達(dá)I型膠原蛋白，I型膠原蛋白的合成在細(xì)胞增值期占主導(dǎo)地位，是成骨細(xì)胞分化擴(kuò)增晚期、基質(zhì)形成早期的產(chǎn)物，在骨形成與礦化過程中發(fā)揮重要作用[9]，一般認(rèn)為 I型膠原與早期成骨分化有關(guān)[10]。另外，I型膠原蛋白是成骨細(xì)胞分泌基質(zhì)中主要的定型成分，是鈣鹽沉著和細(xì)胞附著的支架[11]。

目前雖然對(duì)TGF-β1調(diào)控成骨細(xì)胞的機(jī)制有了一定的研究，但是還應(yīng)加強(qiáng)對(duì)TGF-β1作用成骨細(xì)胞的體內(nèi)研究；同時(shí)，不僅要考慮TGF-β1自身對(duì)成骨細(xì)胞的影響，也應(yīng)將TGF-β1與骨形成相關(guān)的其他細(xì)胞因子和生長因子的協(xié)同作用一并加以研究，在分子水平上探討其作用機(jī)理，探討生長因子之間的相互作用以及生物安全性等方面的問題。TGF-β1在口腔種植領(lǐng)域的應(yīng)用日益增多，為骨種植中關(guān)于骨整合的治療提供新的手段。

4.結(jié)論

經(jīng)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比得出：濃度為0.5ng/ml的外源性TGF-β1對(duì)鈦片表面的成骨細(xì)胞成骨相關(guān)因子表達(dá)有一定的促進(jìn)作用。

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