NF-κB和MMP-9在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義

陳玉燕，謝杰斌，陳榮，葉樂(lè)馳

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 肛腸外科，浙江 溫州 325000）

結(jié)直腸癌是人類常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率和造成的死亡人數(shù)在亞洲大幅增加，尤其是在我國(guó)[1]，位居癌癥相關(guān)性死因的第四、第五位，其轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的主要原因。越來(lái)越多的證據(jù)支持核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor of kappa，NF-κB）在腫瘤發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中起重要作用。同時(shí)也有研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）啟動(dòng)子區(qū)存在NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，NF-κB促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移可能與上調(diào)血管生成因子以及MMPs的表達(dá)有關(guān)[2]。然而，聯(lián)合研究NF-κB、MMP-9與結(jié)直腸癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)47例結(jié)直腸癌患者NF-κB及MMP-9蛋白表達(dá)情況，探討兩者與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源及分組

1.1.1 結(jié)直腸癌組：收集我院2009年5月至2009年10月經(jīng)手術(shù)切除、術(shù)中冰凍及術(shù)后病理診斷明確的結(jié)直腸癌標(biāo)本47例，所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或生物治療。其中男34例，女13例；年齡32～84歲，平均年齡62.55歲（中位數(shù)63）；腫瘤直徑＜5 cm者23例，5～10 cm者22例，＞10 cm者2例；局部有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者18例，無(wú)轉(zhuǎn)移者29例；根據(jù)UICC結(jié)直腸癌TNM分期：0期4例，I期12例，II期14例，III期16例，IV期1例；高分化8例，中分化33例，低分化6例。所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.1.2 癌旁組：取上述結(jié)直腸癌癌旁腸管組織，距離癌灶最邊緣2 cm，常規(guī)病理證實(shí)無(wú)腫瘤侵犯。

1.1.3 近端正常組：取上述近端正常腸管組織，距離癌灶最邊緣10 cm以上，常規(guī)病理證實(shí)無(wú)腫瘤侵犯。

1.2 主要試劑 兔抗人NF-κB P65單克隆抗體（北京中杉）及山羊抗人多克隆MMP-9抗體為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)分別為：sc-372，sc-6840；兩個(gè)SP試劑盒：內(nèi)包含過(guò)氧化氫、封閉用山羊及兔血清、生物素標(biāo)記的二抗、辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，為福建邁新產(chǎn)品。檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液（PBS）、DAB顯色劑、中性樹(shù)脂、蘇木素防脫玻片為北京中杉公司產(chǎn)品。酒精、二甲苯等購(gòu)買于溫州金山公司。

1.3 方法 每個(gè)蠟塊4μm厚連續(xù)切片，采用免疫組化SP二步法檢測(cè)，步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。用PBS做空白對(duì)照，已多次檢測(cè)為陽(yáng)性的標(biāo)本做陽(yáng)性對(duì)照，抗體稀釋濃度為1:100。

1.4 染色結(jié)果判斷 根據(jù)陽(yáng)性表達(dá)部位的信號(hào)強(qiáng)度和細(xì)胞數(shù)兩種標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綜合評(píng)分：①依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度判斷：細(xì)胞無(wú)染色，記0分；細(xì)胞染成淺棕色為弱陽(yáng)性，記1分；細(xì)胞染成棕色且無(wú)背景著色，或細(xì)胞染成深棕色并有淺棕色背景為中等陽(yáng)性，記2分；細(xì)胞染成深棕色且無(wú)背景著色為強(qiáng)陽(yáng)性，記3分。②依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，記0分；陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)≤25%，記1分；25%＜陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜50%，記2分；陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)≥50%，記3分。最后將兩者評(píng)分結(jié)果相乘，其乘積結(jié)果為：①0分者為陰性表達(dá)，最終計(jì)為0分；②1分和2分者為弱陽(yáng)性表達(dá)，最終計(jì)為1分；③3分和4分者為中等陽(yáng)性表達(dá)，最終計(jì)為2分；④6分和9分者為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，最終計(jì)為3分。最終得分為0分和1分者記為陰性，2分和3分者記為陽(yáng)性。

1.5 圖像分析 先在光學(xué)顯微鏡下觀察免疫組化切片表達(dá)情況，然后每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域，在400倍視野下，采用Olympus相機(jī)在同一個(gè)光源、光圈、亮度、色彩飽和度、對(duì)比度及關(guān)閉白平衡條件下進(jìn)行拍照，將所得圖片輸入計(jì)算機(jī)，應(yīng)用美國(guó)Media Cybemetics公司生產(chǎn)的Image-ProPlus（IPP 5.1）圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析。由于平均光密度值（mean optical density，MOD）能代表免疫組化圖片的染色強(qiáng)度，能較為準(zhǔn)確地反映陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)相對(duì)濃度；而且MOD在胞漿和胞核染色陽(yáng)性的免疫組化標(biāo)本中有較好的重復(fù)性[3]，故采用MOD作為測(cè)試指標(biāo)進(jìn)行定量分析比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。NF-κB和MMP-9蛋白分別在結(jié)直腸癌組、癌旁組與近端正常組的陽(yáng)性表達(dá)率比較采用Chi-square Test，所有圖像分析結(jié)果以±s表示，各指標(biāo)與臨床病理特征之間的關(guān)系采用t檢驗(yàn)或方差分析，兩指標(biāo)表達(dá)相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NF-κB和MMP-9蛋白在結(jié)直腸癌組織、癌旁組織及近端組織中的表達(dá)情況 NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為主，部分見(jiàn)于胞核中（見(jiàn)圖1a、b），陰性細(xì)胞未見(jiàn)棕黃色顆粒（見(jiàn)圖1c）；MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞為胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒（見(jiàn)圖1d、e）。陰性細(xì)胞胞質(zhì)不染色（見(jiàn)圖1f）。NF-κB蛋白在癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率為70.2%，明顯高于癌旁組織的29.8%及近端正常腸組織的8.5%（均P＜0.01）；MMP-9蛋白在癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率為76.6%，明顯高于癌旁組織的38.3%及近端正常組織的17.0%（均P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組NF-κB和MMP-9蛋白陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果

2.2 結(jié)直腸癌組織中NF-κB和MMP-9蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 NF-κB蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)直腸癌細(xì)胞分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)（P值分別為0.032、0.01和0.026），而與性別、年齡、腫瘤大小、部位及浸潤(rùn)深度均無(wú)相關(guān)性；MMP-9蛋白陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)（P=0.034），而與性別、年齡、腫瘤大小、部位、浸潤(rùn)深度、細(xì)胞分化程度及臨床分期均無(wú)相關(guān)性。見(jiàn)表2-3。

圖1 NF-κB和MMP-9在各組織中的表達(dá)（SP，×400）

表2 NF-κB蛋白表達(dá)水平及其與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 結(jié)直腸癌組織中NF-κB和MMP-9蛋白表達(dá)的相關(guān)性 結(jié)直腸癌中NF-κB與MMP-9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.489，P＜0.01）（見(jiàn)表4）。

3 討論

NF-κB是一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、惡性轉(zhuǎn)化及浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[4]。在正常細(xì)胞中，NF-κB主要分布于胞漿中，與其抑制物I-κB相結(jié)合，使其滯留在胞漿內(nèi)呈非活性狀態(tài)，當(dāng)受到各種因素刺激時(shí)（如細(xì)胞因子、炎癥因子等），細(xì)胞內(nèi)的NF-κB被激活成為有活性的二聚體形式，轉(zhuǎn)位到胞核，與靶基因上的κB序列特異結(jié)合，啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如炎性因子、黏附分子、化學(xué)趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶，以及多種增殖和凋亡相關(guān)基因，NF-κB活性增強(qiáng)，進(jìn)而使上述基因表達(dá)增加，后者促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[5]。大量研究都證明了NF-κB的活化與腫瘤惡性潛能有關(guān)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤組織中有NF-κB的高表達(dá)和高活性現(xiàn)象，可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及惡性轉(zhuǎn)化影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。然而，NF-κB與腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等關(guān)系上尚存在爭(zhēng)議。本研究通過(guò)對(duì)47例大腸癌患者NF-κB蛋白的檢測(cè)結(jié)果表明：NF-κB蛋白在結(jié)直腸癌組織的表達(dá)明顯高于癌旁組織及近端正常組織（P<0.01），提示NF-κB可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，NF-κB的持續(xù)活化和高表達(dá)可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞異常增殖等途徑參與結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展。另外，本實(shí)驗(yàn)的NF-κB與結(jié)直腸癌臨床病理因素關(guān)系的分析結(jié)果顯示，NF-κB與結(jié)直腸癌細(xì)胞分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P<0.05），目前認(rèn)為的原因可能與其能夠促進(jìn)與腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要因子如MMP-9、血管生成因子等的表達(dá)有關(guān)。

表3 MMP-9蛋白表達(dá)水平及其與臨床病理特征的關(guān)系

表4 結(jié)直腸癌組織中NF-κB與MMP-9的相關(guān)性檢驗(yàn)（n=47）

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一組與鋅結(jié)合的主要分解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系十分密切，其中MMP-9又稱明膠酶B，其作用主要是降解明膠、彈性纖維、II、IV、V、VII和X型膠原[7]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中存在著MMP-9的高表達(dá)，在結(jié)直腸癌中，基底膜IV型膠原蛋白的缺失與腫瘤組織MMP-9的活化形式的表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)[8]。有研究表明，MMP-9拮抗劑可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的移行和黏附[9]，從而提示MMP-9能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。目前，MMP-9在結(jié)直腸癌的定位、表達(dá)情況及作用尚無(wú)定論，有研究認(rèn)為MMP-9只在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)，也有研究稱非癌組織中亦有表達(dá)，更有研究認(rèn)為MMP-9在結(jié)腸炎相關(guān)性腸癌中作為一種腫瘤抑制因子起保護(hù)作用[10]。但大多數(shù)研究認(rèn)為MMP-9可以刺激腫瘤生長(zhǎng)，在大腸癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到關(guān)鍵的作用[11]。而我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：MMP-9蛋白在結(jié)直腸癌組織的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于癌旁組織及近端正常組織（P<0.01），且MMP-9蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)（P<0.05），而與性別、年齡、腫瘤大小、部位、浸潤(rùn)深度、細(xì)胞分化程度及臨床分期均無(wú)相關(guān)性，可能與觀察例數(shù)較少，標(biāo)本來(lái)源不同及染色方法不同等有關(guān)。以上結(jié)果說(shuō)明，MMP-9與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系，其機(jī)制可能跟MMP-9的降解作用使腫瘤細(xì)胞周圍的物理屏障破壞、通過(guò)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的改建，促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)。

雖然關(guān)于NF-κB與MMP-9蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況已有所研究，但聯(lián)合研究二者與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系，探討其是否共同影響結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展以及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移目前還鮮見(jiàn)報(bào)道。有研究表明，NF-κB可以調(diào)控人類惡性腫瘤中的MMP-9的表達(dá)[12]，它可以影響MMPs表達(dá)而調(diào)控轉(zhuǎn)移，MMP-9啟動(dòng)子區(qū)存在NF-κB結(jié)合位點(diǎn),EB病毒致瘤蛋白LMP-1活化區(qū)CTAR-1和CTAR-2能活化NF-κB而使MMP-9上調(diào)[13]。也有學(xué)者研究后推測(cè)肌醇六磷酸（IP6）通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB和AP-1從而調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)[14]。這些研究都說(shuō)明了NF-κB可能通過(guò)上調(diào)MMP-9而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中NF-κB與MMP-9表達(dá)均較癌旁組織和近端正常組織升高，均與結(jié)直腸癌的淋巴轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)，且二者表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.489，P＜0.01），提示了NF-κB可能通過(guò)上調(diào)MMP-9的表達(dá)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的淋巴轉(zhuǎn)移，具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，NF-κB和MMP-9的高表達(dá)與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，二者在結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起著重要作用，聯(lián)合檢測(cè)NF-κB和MMP-9可能為判斷結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供新的生物學(xué)指標(biāo)。

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