誘導型一氧化氮合酶及缺氧誘導因子-1α在人腦膠質瘤的表達意義與腫瘤血管生成關系的研究

胡偉鑫 陳春美 石松生 楊衛(wèi)忠 李紹熹 葉金練

1)福建安溪銘選醫(yī)院神經外科 安溪 362400 2)福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院神經外科 福州 350001

實體瘤生長到一定程度時,腫瘤細胞增殖的速度超過腫瘤血管生成的速度。細胞對氧和營養(yǎng)物質的消耗,可導致腫瘤微環(huán)境為低氧分壓、低糖和酸性。這種情況激活缺氧誘導因子HIF(主要是 HIF-1α),從而誘導血管生成、促進糖酵解,增強腫瘤細胞適應低氧的微環(huán)境[1]。誘導型一氧化氮合酶(iNOS)廣泛參與了膠質瘤的血管生成、增殖與凋亡以及化療耐受等過程,與膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[2]。本實驗采用免疫組化檢測低度和高度惡性膠質瘤標本,分析iNOS、HIF-1α和VEGF在膠質瘤中表達特點及其相關性,為后期膠質瘤靶基因治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 羊抗人的iNOS、HIF-1α和VEGF單克隆一抗體、SP法免疫組化超敏試劑盒和DAB染色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 研究對象 收集協(xié)和醫(yī)院神經外科2005-06～2008-01手術切除的人腦膠質瘤新鮮標本86例,男54例,女32例,年齡最小12歲,最大73歲,平均45.4歲。所有病例均為手術后病理學切片證實為膠質瘤,且均為第一次手術,術前均未行任何抗腫瘤治療。按照2000年WHO腦腫瘤分類標準：Ⅰ～Ⅱ級(低度惡性膠質瘤,低度惡性組)42例,Ⅲ～Ⅳ(高度惡性膠質瘤,高度惡性組)級44例。其中低度惡性組42例包括星形細胞瘤Ⅰ、Ⅱ級27例,少突膠質細胞瘤7例,室管膜下瘤5例,少突-星形細胞瘤 3例;高度惡性組42例,包括膠質母細胞瘤16例,間變性星形細胞瘤11例,間變性少突膠質細胞瘤8例,間變性少突-星形細胞瘤7例。另取腦外傷病人行內減壓手術而取得的新鮮腦組織10例(正常腦組織組)作為對照組。

1.3 免疫組織化學(SP法)檢測iNOS、HIF-1α和 VEGF在不同組標本中表達 取膠質瘤和腦外傷正常腦組織各一份,10%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,3.0μm厚連續(xù)切片,石蠟切片脫蠟至水,抗原修復,加50μL內源性過氧化物酶阻斷液(A液)孵育,漂洗,加 50μL非免疫動物血清(B液)孵育,分別加入50μL的羊抗人 iNOS、HIF-1α和 VEGF一抗,置濕盒4℃孵育過夜,PBS沖洗,加生物素標記二抗50μL(C液)孵育,鏈霉素-生物素-過氧化物酶復合體溶液孵育,DAB呈色,蘇木素復染細胞核,常規(guī)梯度酒精脫水之后封片,中性樹膠封片,取正常腦組織對照。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件對所獲數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。選用兩樣本t檢驗和單因素方差分析、線性回歸分析,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HIF-1α抗原在對照組、低度惡性組和高度惡性組中的表達特點 HIF-1α抗原的表達定位于部分正常腦組織和膠質瘤細胞核上,為黃色或棕黃色顆粒,在腫瘤浸潤邊緣表達明顯。對照組正常腦組織細胞核中不表達或低表達;低度惡性組呈陽性表達,而高度惡性組呈強陽性表達,HIF-1α抗原在3組之間表達強度差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),見表 1、圖 1。

2.2 iNOS抗原在對照組、低度惡性組和高度惡性組中的表達特點 iNOS抗原的表達定位于膠質瘤細胞細胞漿,為黃色或棕黃色顆粒。對照組正常腦組織中不表達;低度惡性組呈陽性表達,而高度惡性組呈強陽性表達,iNOS抗原在2組之間表達強度差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),見表1、圖1。

2.3 VEGF抗原在對照組、低度惡性組和高度惡性組中的表達特點 VEGF抗原的表達定位在正常腦組織組和膠質瘤組細胞均有表達,血管內皮細胞也有表達,呈棕黃色或棕褐色顆粒,其中正常腦組織弱陽性表達,低度惡性組呈陽性表達,而高度惡性呈強陽性表達,3組之間表達強度差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),見表1、圖1。

表1 HIF-1α、iNOS和 VEGF抗原在對照組和膠質瘤組中的累積光密度(IOD) (±s)

表1 HIF-1α、iNOS和 VEGF抗原在對照組和膠質瘤組中的累積光密度(IOD) (±s)

注：與對照組比較,#P＜0.05;與低度惡性組比較,*P＜0.05

組別 n HIF-1α iNOS VEGF對照組 10 71.09±15.74 066.23±8.11低度惡性組 42 196.83±35.52 137.56±8.04#266.26±19.63#高度惡性組 44 348.20±37.16 429.75±62.19#*395.80±70.82#*

圖4 iNOS和VEGF抗原在膠質瘤中線性回歸

2.4 HIF-1α、iNOS和 VEGF抗原在膠質瘤中表達的相關性分析 根據(jù)免疫組化結果進行各種抗原表達相關性分析,在膠質瘤組中,HIF-1α和 iNOS、HIF-1α和 VEGF、iNOS和VEGF均存在正相關關系(r=0.925、0.740、0.852,P值均＜0.05)。見圖2～4。

3 討論

iNOS在缺血、缺氧、腫瘤、損傷時高表達,它可以催化底物L-精氨酸的胍基氮產生NO,發(fā)揮復雜的病理生理學作用。研究發(fā)現(xiàn),iNOS及其產物NO廣泛參與了腫瘤的血管生成、增殖與凋亡以及化療耐受等過程,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。腫瘤在缺氧甚至有氧狀態(tài)下增加糖酵解酶活性而加速糖酵解來獲取能量,缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)發(fā)揮重要的作用,在腫瘤生長、浸潤和轉移、治療等方面都有重要意義。血管內皮生長因子(VEGF)在促進腫瘤血管形成和生長中起著重要作用,主要有[3-4]：(1)增加血管通透性：為腫瘤的生長、浸潤和轉移提供合適的基礎;(2)促進血管生成;(3)調節(jié)細胞周期、抑制凋亡、抑制腫瘤免疫等。目前iNOS、HIF-1α和VEGF三者在膠質瘤的表達特點的相關性還不明確。

目前研究認為,在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中,iNOS、NO、VEGF相互作用促進腫瘤性血管的生成,其中以VEGF的作用更為直接,同時,VEGF受到 iNOS、NO的嚴密調控[5-6]。iNOS不僅通過產物NO和VEGF相互作用發(fā)揮其促血管生成作用,iNOS還可以與VEGF受體結合來調節(jié)血流量,促進腫瘤生長和轉移。Papapetropoulos等學者認為,iNOS、HIF-1α在腫瘤血管形成相互關系可能機制：HIF-1α蛋白穩(wěn)定性增加,不容易降解,上調iNOS表達,進而上調NO,NO是一種重要的炎癥介質,能促進VEGF與其受體結合,促使內皮細胞拉長、伸展,發(fā)生有絲分裂、移行和血管的進一步形成[7]。

本實驗中 iNOS在正常腦組織沒有表達,HIF-1α和VEGF抗原在正常腦組織低表達,三種蛋白在膠質瘤細胞的胞質中均有表達,而且高度惡性組表達均明顯強于低度惡性組,惡性度越高,表達量越多,說明 iNOS、HIF-1α和 VEGF三種基因與膠質瘤惡性度相關,參與膠質瘤發(fā)生發(fā)展過程。采用SPSS軟件分析結果顯示,iNOS、HIF-1α和VEGF三種基因在正常腦組織組、低度惡性組和高度惡性組關系存在兩兩正相關關系,進一步證實 HIF-1α、iNOS和 VEGF等三種基因共同參與膠質瘤發(fā)生發(fā)展過程,HIF-1α和iNOS相互協(xié)調,HIF-1α和iNOS二者在膠質瘤發(fā)展過程中存在相互促進作用,其機制可能為在腫瘤缺氧條件下HIF-1α表達水平增高,誘導iNOS表達,而iNOS催化精氨酸產生的NO,后者則誘導HIF-1α表達,形成正反饋環(huán),促進膠質瘤異常增殖;HIF-1α和iNOS共同促進調控VEGF表達,后者是直接促進膠質瘤血管形成和生長中最為關鍵的因子,三者相互協(xié)調,共同促進膠質瘤生長、增殖和轉移過程。

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