雞胚致病性大腸桿菌的分離與鑒定

劉國慶，溫建新，趙鵬偉，李倩倩，劉 坤

（1.膠南市動物疾病控制中心，山東青島 266400；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109；3.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

2011年4月，在膠州某種雞場19日齡雞胚死亡數(shù)量增加，經(jīng)剖檢時可見卵黃吸收不良，大多為黃綠色物質(zhì)，肝臟腫大出血，經(jīng)過分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)確診為致病性大腸桿菌，通過藥敏試驗(yàn)檢測了病原菌對藥物的敏感性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 膠州某種雞場的一批待檢的19日齡病死雞胚。

1.1.2 試驗(yàn)材料 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB）、三糖鐵培養(yǎng)基（TSI）、用兔血配制的血平板培養(yǎng)基、檸檬酸鹽瓊脂、葡萄糖蛋白胨水；五糖發(fā)酵管（葡、麥、蔗、乳、甘）、H2S、靛基質(zhì)、MR試劑、VP試劑、吲哚試劑、藥敏紙片（購自杭州天和微生物試劑有限公司）；E.coli標(biāo)準(zhǔn)“O”血清、標(biāo)準(zhǔn)菌株均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 方法

1.2.1 病理剖檢 隨機(jī)抽取42只雞胚，觀察尿囊液的變化及內(nèi)臟的病理變化。

1.2.2 細(xì)菌的分離、純化及形態(tài)學(xué)觀察 將病料分別無菌接種到肉湯培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，用滅菌環(huán)挑去肉湯中的培養(yǎng)物分別接種到EMB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑去EMB培養(yǎng)基上的單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。

1.2.3 生化試驗(yàn) 挑取在經(jīng)革蘭氏染色后呈陰性短桿菌的EMB黑色帶有在金屬光澤菌落在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)后，按照常規(guī)方法進(jìn)行TSI、糖發(fā)酵試驗(yàn)[1]、IMViC。

1.2.4 溶血性試驗(yàn) 從EMB培養(yǎng)基中挑取單個菌落接種到兔血配制的血平板上，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)基中是否產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散試驗(yàn)法。其操作方法如下：將分離得到的大腸桿菌和標(biāo)準(zhǔn)菌株在無菌條件下分別接種于肉湯中，然后放入搖床中培養(yǎng) 12 h 后計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)菌液的含菌量為108個/mL。按常規(guī)操作貼好紙片置于 37 ℃培養(yǎng) 12 h 后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 剖檢變化

剖檢時可見卵黃吸收不良，大多為黃綠色物質(zhì)，肝臟腫大出血，羊膜腔出血

2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

經(jīng)37 ℃培養(yǎng)在肉湯中均出現(xiàn)渾濁，管底有黏性沉淀，液面管壁有菌環(huán)；在EMB培養(yǎng)基上出現(xiàn)黑色帶有金屬光澤的菌落；挑取得單個菌落接種到普通培養(yǎng)基上形成表面光滑、濕潤、半透明、灰白色、圓形凸起、中等大小菌落

2.3 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察

經(jīng)革蘭氏染色鏡檢后，均可見粉紅色、兩端鈍圓、多數(shù)散在排列的革蘭氏陰性短桿菌。

表1 病原菌生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 生化試驗(yàn)結(jié)果（見表1）

由表1可見，從雞胚尿囊液和肝臟中分離的細(xì)菌都利用葡萄糖、乳糖、麥芽糖和甘露醇，但不利用蔗糖；吲哚試驗(yàn)出現(xiàn)玫瑰紅色，說明呈陽性，不產(chǎn)生H2S；枸櫞酸鹽不變色，呈陰性；MR試驗(yàn)中液體呈現(xiàn)紅色，說明呈陽性；VP試驗(yàn)觀察到?jīng)]有顏色變化，說明呈陰性；TSI斜面、底部均為黃色，底層產(chǎn)氣。經(jīng)過以上生化試驗(yàn)，可以確診該批雞胚感染了大腸桿菌。

2.5 溶血試驗(yàn)結(jié)果

血平板上出現(xiàn)明顯的溶血現(xiàn)象，說明分離到的大腸桿菌具有致病性。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果（見表2）

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 對生化試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)結(jié)果的討論

本試驗(yàn)通過分離培養(yǎng)和染色鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài)疑似該病原菌為大腸桿菌后，把分離到的細(xì)菌進(jìn)行生化試驗(yàn)，該菌能夠利用葡萄糖、乳糖、甘露醇、麥芽糖產(chǎn)酸，而不能利用蔗糖。典型的大腸桿菌一般都對葡萄糖和乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，但可能不同血清型的細(xì)菌可能生化反應(yīng)不完全一致。在進(jìn)一步做IMViC試驗(yàn)的結(jié)果與大腸桿菌的生化特征基本一致?？梢赃M(jìn)一步確診該批雞胚是感染大腸桿菌致死。另外，血平板上出現(xiàn)明顯的溶血現(xiàn)象，說明大腸桿菌具有一定的致病性。

3.2 致病性大腸桿菌耐藥性的變化

大腸桿菌極易產(chǎn)生耐藥性，不同地區(qū)致病菌的耐藥性差異較大。從分離得到的致病性大腸桿菌藥敏結(jié)果可以看出；對美福仙高度敏感，對慶大霉素、先鋒V中度敏感，而對克林霉素、環(huán)丙沙星、阿米卡星、萬古霉素、紅霉素、氯霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素和青霉素G不敏感?？梢钥紤]用美福仙、慶大霉素、先鋒V藥物對雞大腸桿菌病進(jìn)行治療。因此，通過藥敏試驗(yàn)進(jìn)行治療十分有效的，不僅能測定細(xì)菌對藥物的敏感性，且有助于選擇合適的藥物，為藥物的用量提供依據(jù)[2-3]。然而在臨床治療中投藥的劑量不足，用法不當(dāng)，無明確適應(yīng)癥而濫用抗菌素類藥物，特別是長期應(yīng)用時，往往引起耐藥菌株的產(chǎn)生高敏抗生素的長期使用，必定會產(chǎn)生耐藥性的菌株[4]。雞大腸桿菌病產(chǎn)生耐藥性的原因據(jù)記載：在臨床治療大腸桿菌病時，必須注意合理使用藥物，加強(qiáng)抗生素藥物的質(zhì)量監(jiān)督，注意細(xì)菌耐藥性的檢測，有效的限制耐藥性的產(chǎn)生；同時，要加強(qiáng)不同抗生素的聯(lián)合使用?？傊?，細(xì)菌耐藥性是目前養(yǎng)殖業(yè)所面臨的重大問題之一。

3.3 對防治雞胚感染大腸桿菌的建議

大腸桿菌是條件性致病菌，危害養(yǎng)殖業(yè)的重要病原菌，凡能引起機(jī)體抵抗力降低的各種因素均是引發(fā)本次疾病的原因，特別是各種病毒的感染，都可以誘發(fā)大腸桿菌病。防治該病的關(guān)鍵在于貫徹“養(yǎng)重于防，防重于治”的方針[5]。

因?yàn)殡u胚感染大腸桿菌主要是母體垂直傳播或外界環(huán)境污染所致，所以要預(yù)防雞胚感染大腸桿菌要從預(yù)防種雞感染大腸桿菌和減少雞胚受環(huán)境污染方面采取措施。①加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，禽舍及用具經(jīng)常進(jìn)行清潔和消毒。尤其種禽必須在嚴(yán)格的衛(wèi)生條件下飼養(yǎng)，預(yù)防性用藥并不能代替良好的科學(xué)飼養(yǎng)[6]。②日常要提供全價優(yōu)質(zhì)飼料，并足量補(bǔ)充維生素和電解質(zhì)，夏季注意防暑。③要注意育雛期保溫及飼養(yǎng)密度，及時隔離病弱雛，死雛要及時檢出。④一定要控制糞便污染，因?yàn)槲廴镜姆N蛋很容易造成傳播疾病。⑤進(jìn)行免疫接種。由于禽的致病性大腸桿菌的血清型繁多，會造成疫苗保護(hù)率偏低，因此應(yīng)在疫苗防制之前對當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖場內(nèi)致病性大腸桿菌進(jìn)行監(jiān)測，然后選擇合適的疫苗進(jìn)行免疫。

大腸桿菌的特點(diǎn)是易形成抗藥性，而且大腸桿菌可通過菌毛將其抗藥性質(zhì)粒傳遞給其他大腸桿菌，所以大腸桿菌的抗藥性形成較快，環(huán)境中大腸桿菌耐藥性菌株越來越多[7]。對于感染大腸桿菌的治療，為了減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，應(yīng)先做細(xì)菌藥敏試驗(yàn)，再合理選擇用藥，既縮短治療時間，又避免濫用抗生素，同時要注意交替用藥，按療程投藥，以最大限度減少養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)損失。

[1] 姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版.2002：36-39.

[2] 汪毅，劉永德，劉帥，等.雞大腸桿菌分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2001（4）：19.

[3] 胡桂學(xué).獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：61.

[4] Gaastra W，Great F K.Host-specific Fimbrial Adhesions of Noninvasive Enterotoxigenic E.coli strains[J].Microbiological reviews，1982，46（2）：12-16.

[5] 郭振環(huán)，孔祥峰，黃小燕，等.雞大腸桿菌病的病原菌分離鑒定和藥敏試驗(yàn)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（2）：443.

[6] 孫海虹.禽大腸桿菌病的特性與防治[J].醫(yī)學(xué)動物防制，2005，21（6）：460-462.

[7] 刁有祥，李久芹，陳慶普.山東省雞大腸桿菌的分離鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，24（1）：21-23.