血管活性腸肽在骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨病變組織中的表達(dá)及意義

劉仰斌，鐘美興，張志花，李啟華

(1贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西贛州 341000;2贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種退行性骨關(guān)節(jié)疾病，病因不明確，缺乏有效的防治方法。血管活性腸肽(VIP)是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，又是一種重要的內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)肽，具有廣泛的組織分布和生物學(xué)功能，包括調(diào)節(jié)固有免疫及適應(yīng)性免疫[1]。研究發(fā)現(xiàn)，正常關(guān)節(jié)軟骨中有VIP表達(dá)[2]，亦有研究證明，VIP對膠原誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎模型(CIA)有高效的治療作用[3～5]，明顯減輕CIA的臨床癥狀，抑制關(guān)節(jié)腫脹以及骨和軟骨的破壞。關(guān)于關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)是否存在分泌 VIP的陽性神經(jīng)纖維、OA患者關(guān)節(jié)軟骨中是否表達(dá) VIP、正常關(guān)節(jié)軟骨與骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨表達(dá) VIP是否存在差異等，國內(nèi)外目前鮮見報道。2009年 7月 ～2010年 3月，我們檢測了 OA患者軟骨中 VIP的表達(dá)及 VIP陽性神經(jīng)纖維數(shù)目，探討 VIP的表達(dá)與 OA發(fā)病以及軟骨退變程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科進(jìn)行關(guān)節(jié)置換的 OA患者的關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本共 39份(觀察組)，患者男 19例，女 20例;年齡 45～70歲，平均 55歲。其中髖關(guān)節(jié) 24例，膝關(guān)節(jié) 16例。骨關(guān)節(jié)炎分級(按改良 Mankin病理評分進(jìn)行分級評定[6]):輕度 11例，中度 22例，重度 6例。另取因外傷行截肢的膝關(guān)節(jié)軟骨或股骨頸暴力骨折患者的股骨頭正常關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本 9份(對照組)，患者男 5例，女 4例;年齡 20～45歲，平均 38歲。兩組根據(jù)病史、術(shù)前 X線片及術(shù)后肉眼觀察排除退行性變、腫瘤、結(jié)核、感染、類風(fēng)濕炎癥和明顯骨質(zhì)疏松等。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及處理 術(shù)中取關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本后用雙層塑料袋密封包裹后，立即保存于 -70℃深低溫冰箱中冷凍保存。實驗前 48 h取出置 4℃冰箱中解凍 24 h、室溫下解凍 24 h。參照 Outerbridge標(biāo)準(zhǔn)[7]剪取 0～Ⅳ級各 10個共 50個帶軟骨下骨的軟骨塊，大小為 1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm，置于 4%的多聚甲醛中固定 5 d，然后置于 15%EDTA溶液脫鈣 4～5周，常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片。

1.2.2 相關(guān)指標(biāo)檢測 兔抗人 VIP和 DAB試劑、一抗(抗 VIP抗體)，均購于武漢博士德生物工程有限公司。通用型二抗(SABC法)試劑盒，購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。兩組均行抗 VIP免疫組織化學(xué)染色。應(yīng)用真彩色醫(yī)學(xué)圖像軟件(MidiaCybernetics公司 Image Pro Plus 5.0)分析結(jié)果。①VIP染色陽性纖維數(shù):每張切片隨機(jī)采集 4個高倍視野計數(shù) VIP染色陽性的纖維數(shù)，取平均值;②骨 VIP平均光密度值 (棕黃色)的灰度值進(jìn)行半定量分析。所有玻片均在同一放大倍數(shù)(×400)、同一光強(qiáng)度下分析測量相同面積的平均光密度值(AOD)。AOD=1g225-1gA，A代表測量灰度值[8]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料比較采用 χ2檢驗、秩和檢驗和 Fisher精確概率法，用 Spearman等級相關(guān)進(jìn)行兩變量間的相關(guān)性分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VIP陽性神經(jīng)纖維數(shù) 兩組均可見 VIP陽性神經(jīng)纖維，呈散在分布，表達(dá)于關(guān)節(jié)軟骨的各層，部分終止于中層的軟骨基質(zhì)，部分終止于深層的軟骨細(xì)胞周圍。觀察組輕、中、重度者高倍視野下 VIP陽性纖維數(shù)分別為 7、8、8條，對照組為 7條，無顯著差異。

2.2 VIP表達(dá) 觀察組 AOD值為 0.183 9±0.039 6，對照組為 0.258 0±0.041 7(P＜0.05)。

2.3 相關(guān)性分析 OA患者 VIP平均光密度與軟骨改良 Mankin病理評分呈負(fù)相關(guān)(r=0.799，P＜0.05)。

3 討論

VIP是一種直鏈結(jié)構(gòu)的小分子神經(jīng)肽，在骨骼、循環(huán)、免疫、生殖、消化系統(tǒng)以及中樞、外周神經(jīng)系統(tǒng)中都有廣泛分布，其為特殊類型的神經(jīng)遞質(zhì)，與經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)相比，前者在神經(jīng)元胞體合成，轉(zhuǎn)運致神經(jīng)末梢釋放，經(jīng)酶解滅活;后者在神經(jīng)末梢合成和釋放，經(jīng)重攝取滅活。VIP的主要生理作用為[9，10]:擴(kuò)張血管，降低血壓;松弛非血管平滑肌;刺激腸液分泌并抑制其吸收;刺激胰液分泌水、碳酸氫鹽及膽汁;抑制胃酸分泌;刺激生長激素、黃體生成素、胰高血糖素和生長抑素釋放;調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化;參與晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)等;是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)因子;抑制多種細(xì)胞因子的合成與分泌;參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié);參與骨折愈合、骨的吸收重建和代謝。VIP與其受體結(jié)合后，通過一系列信號傳遞途徑發(fā)揮其生理作用。cAMP依賴的蛋白激酶途徑是 VIP通過其受體發(fā)揮生理作用的主要途徑:VIP與受體結(jié)合后，首先激活腺苷酸環(huán)化酶(AC)，催化 ATP轉(zhuǎn)化為 cAMP，cAMP隨之激活 cAMP依賴性蛋白激酶 A(PKA)。PKA又可使細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)磷酸化，產(chǎn)生生理效應(yīng)，尤其是在細(xì)胞的增殖分化中有重要作用[11]。

VIP陽性神經(jīng)纖維來源、性質(zhì)和功能至今尚不清楚，一般認(rèn)為其屬副交感神經(jīng)纖維，與血管舒張有關(guān)，可能還有感覺功能。研究發(fā)現(xiàn)其主要見于骨骺、骨膜，偶見于血管[12，13]。VIP在體外能有效刺激骨吸收，在骨內(nèi)伴隨神經(jīng)纖維到達(dá)淺層的骨膜間及深層的哈佛氏管系統(tǒng)血管周圍部，由神經(jīng)末梢釋放，在骨內(nèi)局部形成高濃度，從而誘導(dǎo)骨吸收。成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞均能與 VIP結(jié)合，VIP對骨的代謝通過不同的受體來完成。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，兔頜骨中 VIP含量比較豐富，特別是在下頜骨上面。本研究發(fā)現(xiàn)正常軟骨和 OA軟骨中均存在 VIP陽性神經(jīng)纖維，與以往關(guān)于關(guān)節(jié)軟骨中沒有神經(jīng)支配的學(xué)說不相符。原因可能與染色方法有關(guān)。

OA的主要病理特點是關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性變性和消失、關(guān)節(jié)邊緣、關(guān)節(jié)間隙變窄，臨床以關(guān)節(jié)的疼痛腫脹和功能障礙為主。針對 OA的發(fā)病機(jī)理有多種不同學(xué)說和觀點，但確切機(jī)制尚未明確。VIP及其神經(jīng)纖維的廣泛分布和生物作用與眾多的學(xué)說都有一些相關(guān)聯(lián)，推測可能與軟骨下骨質(zhì)的反應(yīng)性變化即軟骨下骨壞死、囊性變、骨密度增加有密切關(guān)系。大量實驗顯示，VIP干預(yù)對膠原誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎模型(CIA)有高效的治療作用，明顯減輕 CIA的臨床癥狀，抑制關(guān)節(jié)腫脹以及骨和軟骨的破壞。其作用機(jī)制主要是免疫調(diào)節(jié)和抑制炎癥[3～5]。

本研究結(jié)果顯示，正常軟骨與 OA軟骨均表達(dá)VIP，但 OA軟骨中的表達(dá)明顯低于正常軟骨，提示VIP降低可能是 OA發(fā)病的機(jī)理之一。本研究還發(fā)現(xiàn) VIP與軟骨改良 Mankin病理評分呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示 VIP低表達(dá)與關(guān)節(jié)軟骨退變程度、OA病程進(jìn)展相關(guān)。

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