免疫膠體金技術(shù)及其應(yīng)用

齊穎穎

（河北省科學(xué)院生物研究所，河北石家莊 050081）

免疫膠體金技術(shù)及其應(yīng)用

齊穎穎

（河北省科學(xué)院生物研究所，河北石家莊 050081）

免疫膠體金技術(shù)近年來(lái)發(fā)展迅速，應(yīng)用范圍極廣。本文綜述了免疫膠體金技術(shù)原理、制備方法及其廣泛應(yīng)用，分析了存在的問(wèn)題，并針對(duì)其存在問(wèn)題提出展望。

免疫膠體金技術(shù)；制備；應(yīng)用

免疫膠體金技術(shù)（ICG）是以膠體金為標(biāo)記物，利用特異性抗原抗體反應(yīng)，在光鏡電鏡下對(duì)抗原或抗體物質(zhì)進(jìn)行定位，定性乃至定量研究的標(biāo)記技術(shù)。1962年Feldherr第一次介紹了膠體金可作為一種電子顯微鏡水平的示蹤記物。1971年，F(xiàn)aulk和Taylor［1］首次用免疫金標(biāo)技術(shù)研究沙門氏菌壁細(xì)胞抗原成分，將膠體金與抗體結(jié)合用于電鏡水平的免疫細(xì)胞化學(xué)研究，這一年被公認(rèn)為免疫膠體金技術(shù)誕生年。1974年Romano EL等將膠體金屬標(biāo)記在馬抗人的IgG上，實(shí)現(xiàn)了間接免疫金染色法。1974年Bauer H等報(bào)道凝集素－金復(fù)合物的應(yīng)用。1978年Geoghe－gan WD等應(yīng)用免疫金技術(shù)檢測(cè)B淋巴細(xì)胞表面抗原。1981年Danscher G用銀顯影方法增強(qiáng)膠體金顆粒的可見度，提高了靈敏度。1983年Holgate［2］CS將銀顯色技術(shù)與免疫金染色法相結(jié)合，建立了免疫金銀染色技術(shù)（Immunogold－silver staining，IGSS）。1986年Fritz P等在免疫金銀法基礎(chǔ)上成功地進(jìn)行了彩色免疫金銀染色，使得結(jié)果更加鮮艷奪目。近年來(lái)，根據(jù)膠體金的物化性質(zhì)，進(jìn)一步拓展了基于膠體金標(biāo)記的生物檢測(cè)技術(shù)及膠體金在其生物學(xué)方面的廣泛應(yīng)用。

1 免疫膠體金技術(shù)的基本原理

免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)中的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金（Colloidal gold）是由氯金酸（HAuC14）水溶液在還原劑作用下，聚合成特定大小的金顆粒，顆粒之間因靜電作用形成一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，也稱金溶膠（Gold so1）。利用膠體金在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷的性質(zhì)，與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)籍靜電吸引而形成牢固的結(jié)合，這種結(jié)合對(duì)所標(biāo)記蛋白質(zhì)的生物活性無(wú)明顯影響。除蛋白質(zhì)分子外，膠體金顆粒還可以與其他多種生物大分子物質(zhì)（如毒素、抗生素、激素、核酸、多肽綴合物等）結(jié)合。

2 免疫膠體金的制備

2.1 膠體金的制備

用還原法從氯金酸溶液中制備不同粒徑（5～150nm）［3］的膠體金顆粒。膠體金的粒徑不同會(huì)呈現(xiàn)不同的顏色。常用的制備方法有白磷還原法、抗壞血酸還原法、檸檬酸三鈉還原法、鞣酸一檸檬酸三鈉還原法、乙醇超聲波還原法和硼氫化鈉還原法［4］。其中最常用的制備方法為檸檬酸三鈉還原法，將0.01%的氯金酸溶液加熱至沸騰，快速攪拌的同時(shí)迅速加入1%的檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱，溶液顏色由淺黃色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色、藍(lán)色、藍(lán)紫色、紫紅色，最后變?yōu)槌吻逋该鞯木萍t色。此法制備程序簡(jiǎn)單，膠體金的顆粒形狀、大小較均一［5］。

2.2 膠體金標(biāo)記蛋白的制備

是蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。在免疫組織化學(xué)中，將膠體金結(jié)合蛋白質(zhì)的復(fù)合物稱為金探針，用于免疫測(cè)定時(shí)多簡(jiǎn)稱為免疫膠體金（immunogold）。最好在標(biāo)記前測(cè)定形成穩(wěn)定膠體金一蛋白質(zhì)復(fù)合物的最小蛋白質(zhì)需要量［6］以及最佳p H值［7］。用K2CO3調(diào)膠體金的最佳p H值，再加入適量抗體，穩(wěn)定劑［8］，最后制備好的膠體金一蛋白質(zhì)復(fù)合物需進(jìn)一步純化，以除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)或膠體金顆粒，一般采用超速離心法。

3 免疫膠體金技術(shù)

3.1 免疫滲濾試驗(yàn)（DIFA）技術(shù)［9］

其基本原理是以微孔膜為固相載體，包被已知抗原或抗體，加入待測(cè)樣本后，經(jīng)微孔膜的滲濾作用或毛細(xì)管虹吸作用使標(biāo)本中的抗體或抗原與膜上包被的抗原或抗體結(jié)合，再通過(guò)膠體金標(biāo)記物（或其他）指示劑之反應(yīng)形成紅色的可見結(jié)果。

3.2 免疫層析［10］（immunochromatography）試驗(yàn)技術(shù)

其原理是將特異的抗體或抗原先固定于硝酸纖維素（NC）膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品尿液或血清后，由于毛細(xì)作用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有抗體或抗原的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原或抗體即與該抗體或抗原發(fā)生特異性結(jié)合，再通過(guò)標(biāo)記技術(shù)使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。膠體金免疫層析（GICA）就是利用膠體金本身的顯色特點(diǎn)結(jié)合免疫層析技術(shù)診斷特異性的待測(cè)物。同樣是層析法的金標(biāo)紙條，根據(jù)膠體金標(biāo)記的東西不同可以分成間接法、競(jìng)爭(zhēng)法和雙抗原夾心法等不同種類。

4 免疫膠體金的應(yīng)用

4.1 免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)在植物方面的研究應(yīng)用

4.1.1 植物病害超微病理的研究［11］

利用免疫電鏡技術(shù)研究植物病害的超微病理，其原理是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與電子顯微鏡的高分辨率相結(jié)合，在亞細(xì)胞和超微結(jié)構(gòu)水平上對(duì)抗原物質(zhì)進(jìn)行定位分析。特異性抗體用鐵蛋白、膠體金或過(guò)氧化物酶標(biāo)記后，使之與組織超薄切片中的抗原結(jié)合，在電鏡下觀察到標(biāo)記物的所在位置，即為抗原抗體的反應(yīng)部位。2002年，李紅葉［12］等利用免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)寄主體內(nèi)的葡萄扇葉病毒（Grapevine fanleaf virus GFLV）移動(dòng)蛋白，進(jìn)一步證實(shí)了GFLV是通過(guò)管狀結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞問(wèn)移動(dòng)的。彭日荷［13］等同樣利用此技術(shù)研究了甜菜多粘菌傳帶甜菜壞死黃脈病毒的部位。

4.1.2 植物病害的快速檢測(cè)

利用膠體金免疫層析法和斑點(diǎn)滲濾法可準(zhǔn)確、靈敏、快速地檢測(cè)植物病害，并具有操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，克服了傳統(tǒng)鑒定方法時(shí)間久、操作程序復(fù)雜、無(wú)法及時(shí)診斷潛伏侵染的病害等缺點(diǎn)。

4.1.3 植物－病原物互作的研究

利用基因芯片技術(shù)植物－病原互作的分子機(jī)制，尤其是在檢測(cè)與病害發(fā)生發(fā)展有關(guān)的植物－病原物互作基因方面有著美好的前景?；蛐酒夹g(shù)是指通過(guò)微陣列技術(shù)將告密度DNA片段陣列通過(guò)高速機(jī)器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，標(biāo)記DNA探針，借助堿基互補(bǔ)雜交原理，進(jìn)行大量的基因表達(dá)及監(jiān)測(cè)等方面研究的最新革命性技術(shù)。利用膠體金標(biāo)記寡聚核苷酸，制備DNA探針，應(yīng)用于基因芯片技術(shù)。將捕獲DNA固定到玻片基質(zhì)上，加入膠體金標(biāo)記寡聚核苷酸探針，如互補(bǔ)則可發(fā)生特異性結(jié)合，經(jīng)銀加強(qiáng)技術(shù)后，通過(guò)顯微鏡或肉眼可直接觀察到結(jié)果。

4.1.4 轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的檢測(cè)

以轉(zhuǎn)基因植物中外源目標(biāo)基因表達(dá)的產(chǎn)物為抗原，制備其特異性抗體，用膠體金標(biāo)記抗體，制作免疫層析試紙條或斑點(diǎn)滲濾試劑盒，可快速、靈敏地檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品，并可通過(guò)定量或半定量技術(shù)初步鑒定其質(zhì)量。

4.1.5 膠體金免疫在植物檢疫上的應(yīng)用

由于以膜為固相載體的免疫膠體金快速診斷技術(shù)即免疫層析技術(shù)和斑點(diǎn)滲濾技術(shù)可檢測(cè)各種細(xì)菌、真菌、病毒等植物病害，且具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便可大批量地檢測(cè)樣品等優(yōu)點(diǎn).可用于跨區(qū)域引種、調(diào)種及海關(guān)的植物檢疫。

4.2 免疫膠體金在動(dòng)物方面研究應(yīng)用

4.2.1 免疫膠體金在病毒害檢測(cè)中應(yīng)用

膠體金免疫層析技術(shù)在動(dòng)物檢疫工作中廣泛用于諸如豬瘟、藍(lán)耳病、細(xì)小病毒病等傳染病病源微生物的抗原、抗體檢測(cè)，也可用于一些違禁和超量使用激素如性激素殘留的檢測(cè)。此外，該技術(shù)還可用于其它一些微量物質(zhì)的檢測(cè)，如抗生素殘留檢測(cè)等。膠體金免疫層析作為一種可靠的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速、無(wú)需特殊儀器設(shè)備，在動(dòng)物檢疫實(shí)際工作中有廣泛應(yīng)用價(jià)值。

4.2.2 免疫膠體金技術(shù)在禽病［14］診斷中的應(yīng)用

隨著世界范圍內(nèi)養(yǎng)禽業(yè)的規(guī)模不斷擴(kuò)大，禽病對(duì)養(yǎng)殖的危害也隨之加劇。對(duì)家禽疾病進(jìn)行有效防治的關(guān)鍵是快速準(zhǔn)確地進(jìn)行診斷并弄清致病因子。伴隨著病原檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，免疫膠體金技術(shù)以其快速，簡(jiǎn)便，可單份檢測(cè)，靈敏度高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，檢測(cè)標(biāo)本種類多等優(yōu)點(diǎn)開始被逐漸應(yīng)用于禽病的病原診斷。例如：王長(zhǎng)美等用免疫膠體金試驗(yàn)診斷－發(fā)病率高、死亡快、疑似禽I型副粘病毒感染的鵝病例 結(jié)果為禽流感陰性，根據(jù)臨床癥狀和病變情況、免疫膠體金試驗(yàn)以及病毒分離和鑒定，證明該鵝群患禽I型副粘病毒病，實(shí)現(xiàn)了對(duì)禽1型副粘病毒病的快速鑒別診斷。

4.2.3 昆蟲病理學(xué)研究

利用免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)同免疫電鏡技術(shù)、基因芯片技術(shù)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)結(jié)合將會(huì)給在組織細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)水平上闡明昆蟲病理的本質(zhì)問(wèn)題帶來(lái)光明的前景。

4.2.4 介體傳毒識(shí)別傳毒機(jī)理的研究

以免疫膠體金為標(biāo)記物的組織細(xì)胞學(xué)定位技術(shù)研究病毒－介體互相識(shí)別的分子細(xì)胞學(xué)過(guò)程，可揭示介體識(shí)別傳毒?；缘姆肿訖C(jī)理，為植物抗病毒生物工程及用藥物處理病毒受體的介體途徑防治病毒病提供科學(xué)依據(jù)。

4.3 免疫膠體金快速檢測(cè)技術(shù)在臨床中的研究應(yīng)用

早孕診斷［15］用的免疫層析試紙條（通常又叫尿妊紙條）是一個(gè)成功的例子，Hasan等人用免疫層析法檢測(cè)糞便中的霍亂弧菌，得到了理想的效果。王中力等人用自制的犬細(xì)小病毒（CPV）試紙條檢測(cè)CPV抗原，具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。李兆隆等［16］研制了檢驗(yàn)人精漿特異蛋白P30的免疫膠體金試紙條，主要用于法醫(yī)物證檢驗(yàn)。曲萌等［17］采用膠體金標(biāo)記鼠抗人Ig M單克隆抗體制成免疫層析試紙條，檢測(cè)肝炎病毒Ig M抗體。

4.4 免疫膠體金在生物傳感器上的研究及應(yīng)用［18］

近年來(lái)金標(biāo)記被引入生物傳感器中的應(yīng)用研究增多。Kim J H等通過(guò)交流電導(dǎo)法檢測(cè)了在叉指電極上的金標(biāo)記的免疫凝集，從而實(shí)現(xiàn)了膠體金免疫層析試驗(yàn)的電化學(xué)檢測(cè)方法，并且通過(guò)在膠體金上包被導(dǎo)電聚合物聚苯，提高電導(dǎo)法測(cè)定金標(biāo)免疫反應(yīng)的靈敏度。2003年Brainina K等在標(biāo)記膠體金標(biāo)記A蛋白的基礎(chǔ)上，制作了診斷森林腦炎的電化學(xué)免疫傳感器 檢測(cè)血清中的森林腦炎抗體及其濃度，應(yīng)用膠體金催化性質(zhì)的修飾酶生傳感器的電極表面。TangD等基于鉑金電極修飾的膠體金提高了生物傳感器檢測(cè)HABS表面抗體敏感性和穩(wěn)定性。Kitano H等用基于膠體金表面等離子共振效應(yīng)的電感受器測(cè)定胃蛋白酶的親和常數(shù)。

5 免疫膠體金技術(shù)存在的問(wèn)題及應(yīng)用展望

存在問(wèn)題：（1）膠體金顆粒大，滲透能力相對(duì)較差；（2）在操作過(guò)程中要求清潔程度高；（3）膠體溶液的穩(wěn)定性較差，這些問(wèn)題導(dǎo)致免疫膠體金技術(shù)的應(yīng)用受到一定限制。

免疫膠體金技術(shù)是基于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、單克隆抗體技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)［19］和新材料技術(shù)的新型技術(shù)，具有便捷、靈敏、安全、低成本等特點(diǎn)，在診斷領(lǐng)域中迅速推廣，已日趨成熟。免疫膠體金技術(shù)目前和今后的研究趨勢(shì)有3個(gè)方面：①進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度［20］；②實(shí)現(xiàn)檢測(cè)多元化可采用在同一膜上作多種項(xiàng)目測(cè)定和多項(xiàng)目的組合測(cè)定2種方式，一次檢測(cè)可同時(shí)得到一組結(jié)果，這對(duì)于檢測(cè)某些具有聯(lián)檢意義的物質(zhì)具有很大的應(yīng)用價(jià)值；③實(shí)現(xiàn)定量或半定量檢測(cè)［21］。

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Immune colloidal gold technique and its applications

QI Ying－ying

（InstituteofBiology，HebeiAcademyofSciences，ShijiazhuangHebei050081，China）

Immune colloidal gold technique has developed rapidly in recent years，and applied range field of applications.This paper summarizes the technical principles，preparation methods，widely usage，analyzes and proposes of the existing problems.In addition，it analyses the existent problems and raises prospects on those problems.

Immune colloidal gold technique；Preparation；Application

Q78

：A

1001－9383（2011）04－0036－04

2011－06－30

齊穎穎（1988－），女，河北省滄州人，主要從事細(xì)胞生物學(xué)研究.