大鼠胚胎冷凍保存技術(shù)及研究進(jìn)展

張 麗,譚竹鈞,劉 牧

(1.廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，北京 100021)

大鼠是常用實(shí)驗(yàn)動物之一，在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中均有較高應(yīng)用價(jià)值。隨著大鼠基因序列測序的完成和基因敲除技術(shù)的發(fā)展，通過轉(zhuǎn)基因、基因敲除等生物工程技術(shù)已成功建立的人類大鼠疾病模型日漸增多，如高血壓大鼠、心臟病大鼠、糖尿病大鼠等。以常規(guī)的繁殖方式維持這些大鼠品系，不但需要大量的飼養(yǎng)空間和維持經(jīng)費(fèi)，還可能隨時發(fā)生遺傳變異、漂移和遺傳污染[1]。通過冷凍保存大鼠胚胎的方法建立冷凍胚胎庫，不僅可以防止由各種原因造成有價(jià)值的品系和稀有突變體品系的丟失；預(yù)防群體內(nèi)的遺傳變異，漂移和遺傳污染；防止疾病的傳播等。此外，冷凍胚胎保種，還便于運(yùn)輸和進(jìn)行地區(qū)間和國際間的交流。

大鼠胚胎冷凍技術(shù)最早由Whi t tingham等[2]建立，首次利用二甲基亞砜(DMSO)作為冷凍保護(hù)劑，通過慢速冷凍對大鼠胚胎冷凍獲得成功。此后,相關(guān)學(xué)者對大鼠胚胎冷凍保存進(jìn)行了大量的研究, 取得了一定的研究成果。由最早的人工控制緩慢冷凍，到利用電子計(jì)算機(jī)控制的胚胎冷凍裝置進(jìn)行簡便、快速的程序化冷凍，以及玻璃化冷凍。本文綜述了大鼠胚胎冷凍保存技術(shù)的研究進(jìn)展。

1 冷凍保護(hù)劑

冷凍保護(hù)劑是指可以保護(hù)細(xì)胞在低溫或超低溫時產(chǎn)生損害(物理性、化學(xué)性)等的一類化合物。其作用機(jī)理為：冷凍保護(hù)劑可以與溶液中水分子結(jié)合或相互作用，從而降低冰點(diǎn)，減少冰晶形成，降低胚胎細(xì)胞外冰晶對細(xì)胞產(chǎn)生的損傷[3]。冷凍保護(hù)劑常與適宜的培養(yǎng)液配制成一定濃度的溶液，作為冷凍保護(hù)液。冷凍保護(hù)劑的分類：

1.1 低分子量滲透性冷凍保護(hù)劑

低分子量滲透性冷凍保護(hù)劑主要包括甘油(Gl ycer in)、二甲基亞砜(DMSO)、乙二醇(EG)、丙烯二醇(PG)、乙酰胺(Acetamide)、甲醇(Methanol)等。此類冷凍保護(hù)劑分子量小, 能滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定濃度差，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷；同時細(xì)胞內(nèi)水分不會過度外滲，避免細(xì)胞過分脫水皺縮。但它們對胚胎也有一定毒害作用，尤其在高濃度或高溫下毒害作用更大。選擇該類物質(zhì)作為冷凍保護(hù)劑需優(yōu)先考慮其細(xì)胞毒性，滲透性次之。此類保護(hù)劑在玻璃化冷凍中得到廣泛的應(yīng)用。如乙二醇,形成玻璃化能力弱，但其毒性低、滲透性好，與形成玻璃化能力強(qiáng)的冷凍保護(hù)劑(DMSO等)組合，可組合成多種效果較好的玻璃化冷凍液。另外，冷凍劑對胚胎的滲透性及毒害作用不僅取決于冷凍劑本身的性質(zhì)，還與胚胎所屬動物種屬及發(fā)育階段有關(guān)[4]。

1.2 低分子量非滲透性冷凍保護(hù)劑

低分子量非滲透性冷凍保護(hù)劑指某些糖類,例如單糖(葡萄糖、果糖、山梨醇和甘露醇)和一些二糖(蔗糖、海藻糖)，多糖(棉子糖)。目前應(yīng)用最廣泛的是蔗糖。冷凍液中添加的糖類有兩大特性，一是既能提高滲透壓來促進(jìn)細(xì)胞脫水，保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整。在糖溶液中預(yù)平衡能夠使細(xì)胞脫出更多水分，減少胚胎與毒性大的滲透性冷凍保護(hù)劑接觸時間；二是減小達(dá)到玻璃化所需的滲透性冷凍保護(hù)劑的濃度。這兩個方面均可降低冷凍保護(hù)劑對胚胎的毒害作用。另外，糖類還可作為滲透壓緩沖物質(zhì)，通過減少解凍時細(xì)胞的膨脹速率和程度減少滲透性損傷的發(fā)生。這類冷凍保護(hù)劑在低溫下對胚胎無毒害作用，但是溫度升高時卻對細(xì)胞有毒害作用[5]。多糖和二糖在室溫下不易溶解并且容易從溶液中析出，同時二糖需要較高濃度才能形成玻璃化狀態(tài)。

1.3 大分子物質(zhì)

大分子冷凍保護(hù)劑主要有聚乙二醇(PG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、聚蔗糖(Ficol l)、羥乙基淀粉(Hydroxyethyl Starch)、透明質(zhì)酸鈉(Soduim Hyaluronate)、葡聚糖(Glucan)等聚合物。這類冷凍保護(hù)劑比滲透性冷凍保護(hù)劑毒性低，且有促進(jìn)玻璃化作用, 能部分替代其他非滲透性冷凍保護(hù)劑，降低冷凍液的毒性。胚胎解凍時比冷凍時更易形成使細(xì)胞致死的冰晶，因此克服解凍時所形成的致死冰晶至關(guān)重要。據(jù)報(bào)道，許多大分子物質(zhì)如聚乙二醇、聚蔗糖、透明質(zhì)酸等都具有阻止解凍時形成冰晶的作用。目前該類冷凍保護(hù)劑的保護(hù)機(jī)制尚不完全清楚。史洪才[6]推測，大分子保護(hù)劑可以優(yōu)先結(jié)合溶液中的水分子，從而降低溶液中自由水含量，減少冰晶的形成；使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕冷凍中溶質(zhì)對細(xì)胞產(chǎn)生的損傷；復(fù)溫時使細(xì)胞外液的滲透壓變化較為穩(wěn)定等。

2 常用冷凍方法及比較

2.1 常規(guī)慢速冷凍

常規(guī)慢速冷凍由Whi t t ingham等[7]首先發(fā)明，對小鼠胚胎冷凍保存獲得成功，解凍后移植產(chǎn)下后代。隨后，牛(Wilmut 和 Rowson，1973)、家兔(Whittingham 和 Adan-ls，1976)、大鼠(Whittingham，1975)、山羊(Bihon 等，1976)和綿羊(Wdhdsen 等，1976)等動物的胚胎超低溫保存也相繼取得成功。將胚胎依次放入一系列逐漸增加冷凍保護(hù)劑(如DMS0、丙三醇和乙二醇)濃度的溶液中梯度脫水，再利用程序冷凍儀或不同溫差的冰箱分階段降溫。Wi l ladsen[8]在此基礎(chǔ)上做了改進(jìn), 在降溫達(dá)到-35℃～-38℃后直接投入液氮中保存，將冷凍時間縮短到2 h之內(nèi)。目前常規(guī)慢速冷凍在冷凍保護(hù)劑的選擇、添加方式、平衡時間、植冰溫度及降溫速率等環(huán)節(jié)已形成了一整套完整的技術(shù)流程，且被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中，為大鼠胚胎冷凍的研究提供了可行的模式。

大鼠胚胎常規(guī)慢速冷凍的具體操作步驟如下：①室溫下將胚胎置于冷凍液中，5～10min,使胚胎和冷凍液間達(dá)到平衡; ②在 -5℃～-9℃進(jìn)行人工植冰; ③以0.3℃～0.6℃/min的速率緩慢降溫; ④降溫到-30℃～-40℃，投入到-196℃的液氮中保存。

常規(guī)慢速冷凍法采用低濃度的冷凍保護(hù)劑，對胚胎毒害小，解凍后胚胎的存活率和移植成活率都較高；在儲存和運(yùn)輸時，對于環(huán)境溫度的變化有更大的耐受力。但操作過程繁瑣，費(fèi)時較長，需要人工植冰，又需要程序冷凍儀，實(shí)驗(yàn)成本較高。

2.2 玻璃化冷凍

自1985年Ral l y等[9]用玻璃化溶液冷凍小鼠8-細(xì)胞胚胎獲得成功以來，經(jīng)Schefen等[10]、Nakagata[11]、Kasai等[12]、Zhu等[13,14]、Szélld等[15]、Vincent等[16]、Saha[17]以及 Dobinsky等[18]研究者的不斷改進(jìn)，玻璃化冷凍技術(shù)日趨成熟，并廣泛用于馬、兔、牛、山羊、豬等家畜不同階段胚胎的冷凍保存[19,20]。

這種方法采用快速降溫和高濃度的冷凍保護(hù)劑，使冷凍過程中溶液變得十分黏稠和堅(jiān)固，不形成冰晶?？焖俳禍乜梢允共ＡЩ芤褐欣鋬霰Ｗo(hù)劑的濃度降低，降低冷凍保護(hù)劑對胚胎的毒害作用。為提高冷凍速率，研究人員發(fā)明了許多非常有創(chuàng)意的冷凍載體，其中最受歡迎的是由Vaj ta發(fā)明的OPS法[21]。OPS法是利用加熱將細(xì)管拉長拉細(xì)，使管壁變薄、細(xì)管頸部體積變小來提高冷凍速率，其冷凍速率可達(dá)20 000℃/min以上。采用該法冷凍胚胎可以防止冷凍損傷、降低冷凍保護(hù)劑對胚胎產(chǎn)生的毒性和滲透性損傷。但高濃度的冷凍保護(hù)劑會對胚胎產(chǎn)生毒害作用。因此尋找毒性低、形成玻璃化能力強(qiáng)的玻璃化冷凍液成為胚胎玻璃化冷凍研究的關(guān)鍵和熱點(diǎn)之一，也是大鼠胚胎冷凍的研究熱點(diǎn)。有關(guān)研究表明，把不同種類的冷凍保護(hù)劑組合成玻璃化冷凍液，能達(dá)到降低冷凍保護(hù)劑對胚胎毒害作用，提高玻璃化冷凍效果的目的。

玻璃化冷凍操作簡單，整個冷凍過程僅持續(xù)不過一兩分鐘，且不需要昂貴的儀器設(shè)備，有利于野外操作及大規(guī)模推廣應(yīng)用。不利的因素主要是對實(shí)驗(yàn)室工作人員的熟練操作程度要求極高。玻璃化冷凍的全部操作必須在規(guī)定的數(shù)分鐘或更短的時間內(nèi)完成，否則高濃度的冷凍保護(hù)液會對胚胎造成一定的毒害作用，甚至致胚胎死亡。尋求對胚胎低毒或無毒的化合物，是玻璃化冷凍方法急需解決的問題。近年來對玻璃化胚胎冷凍研究趨向于在冷凍保護(hù)劑中添加其他物質(zhì)，如糖類、抗凍蛋白、透明質(zhì)酸、松弛素、鹽等，以提高冷凍效果和冷凍成功率[22]。

3 解凍方法

解凍方法對胚胎的存活和能否進(jìn)一步發(fā)育有很大的影響。實(shí)驗(yàn)證明，冷凍胚胎的快速解凍優(yōu)于緩慢解凍。采用快速解凍，胚胎在0～40 s內(nèi)由-196℃迅速上升至30～35℃, 瞬間通過危險(xiǎn)溫區(qū)，使冰晶來不及形成。為了避免冷凍保護(hù)劑對胚胎產(chǎn)生毒害作用，解凍后需立即除去冷凍保護(hù)劑，通常用蔗糖溶液一步法或階梯法，分步將冷凍保護(hù)劑脫出。目前，蔗糖的濃度還沒有一致的共識，但常用0.25～0.5mol/mL的蔗糖作為梯度解凍液。

大鼠冷凍胚胎的解凍步驟：①胚胎冷凍管自液氮中取出后在室溫下的空氣內(nèi)(20～28℃)停留10～15 s；②將含胚胎的冷凍管投入37℃，水浴10～30 s，輕輕搖動；③冷凍管內(nèi)加入1mL預(yù)熱至37℃的0.25mol/mL蔗糖溶液，移入35mm或60mm培養(yǎng)皿中，立視顯微鏡下檢出形態(tài)良好的胚胎(或用含0.25mol/mL，0.5mol/mL蔗糖的PBS緩沖液分兩步)脫除冷凍保護(hù)劑并使胚胎復(fù)水；④移入培養(yǎng)液(大鼠體外受精液)觀察其復(fù)蘇發(fā)育情況；或在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，應(yīng)用R2ECM大鼠早期胚胎發(fā)育培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；或準(zhǔn)備移植。

4 研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景

4.1 研究現(xiàn)狀

大鼠胚胎冷凍-解凍后的復(fù)蘇率和移植率是大鼠胚胎冷凍技術(shù)面臨的最主要問題。為此相關(guān)科學(xué)家針對低溫保護(hù)劑、冷凍方法、解凍方法等各方面開展了一系列的研究，并取得了一定的成果。

1975年Whit tingham等[2]首次利用二甲基亞砜(DMSO)作為冷凍保護(hù)劑，通過慢速冷凍對大鼠胚胎冷凍獲得成功。采用1.5mol/L、3mol/L的DMSO作為冷凍劑，對大鼠的2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞期胚胎進(jìn)行冷凍，冷凍和解凍步驟與其在1972年成功冷凍小鼠8-細(xì)胞期胚胎相似，解凍后胚胎正常率也與小鼠相近。不同的是，解凍后不同階段的大鼠胚胎在進(jìn)行體外培養(yǎng)時差異卻很大。例如：經(jīng)冷凍-解凍后61%的8-細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后能發(fā)育至囊胚；但僅有30%的2-細(xì)胞可發(fā)育至4-細(xì)胞。大鼠體外培養(yǎng)的胚胎在4-細(xì)胞期后產(chǎn)生發(fā)育阻滯，而不像小鼠那樣在體外培養(yǎng)時會產(chǎn)生2-細(xì)胞期發(fā)育阻滯。這一現(xiàn)象與Folstad[23]，Mayer[24]、Toyoda[25]等對大鼠2～8-細(xì)胞期的新鮮胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)的結(jié)果相一致。冷凍-解凍后正常胚胎對代孕鼠進(jìn)行移植，2-細(xì)胞期冷凍胚胎移植后約可獲得11%的新生仔鼠。

冷凍保護(hù)劑的改良使得復(fù)蘇后大鼠胚胎的發(fā)育能力大大提高。如1977年Miyamoto[26]等用乙二醇作為主要的冷凍劑，對大鼠2～8-細(xì)胞期胚胎進(jìn)行冷凍，復(fù)蘇后64%的胚胎可發(fā)育至桑葚胚。1982年Kasai[27]等用甘油作為主要的冷凍劑，解凍后71%的胚胎能發(fā)育至桑葚胚。隨后大量的研究亦證明，在大鼠的胚胎冷凍中，以甘油作為冷凍劑的效果比乙二醇好。

1988年T Kono等[28]首次采用玻璃化冷凍法對大鼠囊胚進(jìn)行冷凍獲得成功。以二甲基亞砜、乙酰胺、丙二醇及乙二醇組合液作為冷凍保護(hù)劑，胚胎在室溫下冷凍液預(yù)平衡后直接投入液氮中保存。解凍后79%(117/149)的胚胎形態(tài)正常，100% (48/48)的胚胎在體外培養(yǎng)能發(fā)育至擴(kuò)張或孵出囊胚；假孕鼠移植獲得41%(28/69)的新生仔鼠。隨著玻璃化冷凍方法在馬、兔、牛、山羊、豬等家畜不同階段胚胎的冷凍保存中的廣泛應(yīng)用，玻璃化冷凍方法在大鼠胚胎冷凍中的研究亦漸成熱點(diǎn)。

近10年來，國內(nèi)外學(xué)者在大鼠胚胎冷凍技術(shù)上做了大量研究并取得了很大的進(jìn)步。國內(nèi)研究：如梁成光等[29]對大鼠囊胚進(jìn)行常規(guī)慢速冷凍、玻璃化冷凍、OPS冷凍-解凍，用Whi t ten培養(yǎng)液在37.5℃、100%濕度和5%C02條件下進(jìn)行發(fā)育培養(yǎng)，24 h后胚胎解凍存活率分別為82.4%、76.9%和85.7%；48 h后孵化率分別為47.1%、46.1%和53.6%。但是3種方法的存活率及孵化率均無顯著差異。徐平等[30]對5日齡大鼠胚胎進(jìn)行了玻璃化冷凍方法和緩慢冷凍方法的比較研究，胚胎復(fù)蘇率分別為60.46%和64.29%。移植后受孕率分別為39.47%和42.56%。兩種方法的復(fù)活率和受孕率亦無顯著差異。2008年周生來等[31]選用1mol/L的DMSO和DAP213冷凍劑對大鼠2-細(xì)胞期胚胎進(jìn)行兩步玻璃化凍存，平均復(fù)蘇率達(dá)85%～88.3%，產(chǎn)仔率達(dá)37.14%。

國外研究：如2003年Han等[32]選用EFS20和EFS40玻璃化冷凍液，利用兩步法對大鼠各階段(1-細(xì)胞、2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞等)胚胎進(jìn)行凍存，復(fù)蘇率達(dá)到94%～100%，獲得了很好的凍存效果。2003年Isachenko等[33]對大鼠早期桑葚胚、早期囊胚、囊胚及擴(kuò)張囊胚進(jìn)行兩步法玻璃化冷凍，其復(fù)蘇率分別為81%、83%、34%和76%。研究發(fā)現(xiàn)該方法不適合囊胚期冷凍，適用于冷凍其它三個階段的胚胎。2009年 Sei ta等[34]采用玻璃化冷凍法對大鼠原核期胚胎進(jìn)行冷凍獲得成功。室溫下，胚胎于冷凍液1(7.5%EG+7.5% DMSO+20% FCS)和冷凍液2(15% EG+15%DMSO+0.5mol/L Sucrose+20% FCS)中預(yù)平衡后直接投入液氮中進(jìn)行保存。復(fù)蘇后胚胎獲得較高的存活率：82%～96.1%的胚胎能發(fā)育到2-細(xì)胞，36.5%～40.3%能發(fā)育至囊胚。

4.2 應(yīng)用前景

在冷凍保護(hù)劑的研究中，一些生物活性物質(zhì)漸成研究的熱點(diǎn)。這類用于冷凍保護(hù)的生物活性物質(zhì)主要包括牛血清白蛋白(BSA)、抗凍蛋白(AFPs)和熱滯蛋白(THPs)等。血清是冷凍基礎(chǔ)液的成分之一, 能夠穩(wěn)定胚胎細(xì)胞膜、阻止胚胎或卵母細(xì)胞透明帶在冷凍過程中硬化。抗凍蛋白(AFPs)是一類能在低溫條件下生存的生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，其不僅可非依數(shù)性地降低溶液冰點(diǎn)，對冷凍細(xì)胞和胚胎起高效的保護(hù)作用，還能與細(xì)胞膜作用，封閉離子通道，阻止溶質(zhì)滲透，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性。AFP和THP可與細(xì)胞膜相互作用，改善細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，在低溫下保護(hù)胚胎不受損傷[29]。熱滯蛋白(THPs)在高濃度下對細(xì)胞無毒性作用，其分子量大，不影響細(xì)胞的滲透壓，同時還可以溶解在緩沖液或玻璃化液中[35]。

AFPs自發(fā)現(xiàn)以來引起了許多學(xué)者的興趣，其結(jié)構(gòu)和抗凍機(jī)理的研究更是被關(guān)注的熱點(diǎn)。近年來，越來越多的越冬昆蟲和植物被認(rèn)為以生產(chǎn)抗凍蛋白作為其對低溫適應(yīng)的策略。若抗凍蛋白能在大鼠胚胎冷凍技術(shù)中成功應(yīng)用，則可能使胚胎冷凍保存上一個新臺階。

大鼠胚胎冷凍保存技術(shù)的研究雖取得了一定進(jìn)展,但仍存在許多不足之處。如對冷凍保存的機(jī)理尚不完全清楚。尤其是在冷凍過程中對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(如膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架等)的損傷機(jī)理方面研究甚少；胚胎在體外培養(yǎng)的發(fā)育率和體內(nèi)移植后的產(chǎn)仔率較低(37%～43%)[25,27]；冷凍保存過程中的技術(shù)環(huán)節(jié)仍有待于規(guī)范化和簡單化。為此,廣大科研工作者要在現(xiàn)有方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討冷凍保存過程中細(xì)胞損傷的機(jī)理；提高冷凍-復(fù)蘇率等低溫生物學(xué)領(lǐng)域遺留的難題。

感謝：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所張連峰教授對本課題從經(jīng)費(fèi)和技術(shù)指導(dǎo)各方面給予的大量、慷慨的幫助，特此表示衷心感謝！

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