改性絲素抗凝血材料研究進(jìn)展及抗凝血原理*

成國(guó)濤 周 嬋 侯春春 徐 水

(西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶北碚 400716)

血液在正常情況下自己會(huì)自動(dòng)從流動(dòng)態(tài)變?yōu)椴涣鲃?dòng)的凝膠態(tài)，正是依賴(lài)于血液這一性質(zhì)，動(dòng)物體才不會(huì)因?yàn)樾⌒〉某鲅鴨噬?。但這一保護(hù)機(jī)制有時(shí)候卻會(huì)給我們帶來(lái)麻煩，例如，它會(huì)在正常的人體內(nèi)形成血栓，從而造成心腦血管方面的疾病;還有，我們?cè)谘和肝龅臅r(shí)候不希望血液凝固。因此，抗凝血類(lèi)藥物一直是我們孜孜以求的。隨著人工器官、組織活性生物材料和裝置的迅速發(fā)展，對(duì)生物醫(yī)用材料的抗凝血性要求也越來(lái)越高。凡是與血液直接接觸的生物醫(yī)用材料，如人工心臟、人工血管、人工心血管的輔助裝置及各種進(jìn)入或留置血管內(nèi)與血液直接接觸的導(dǎo)管、功能性支架等醫(yī)用裝置等，都要求與血液接觸后不引起血漿蛋白的變性，不破壞血液的有效成分，不導(dǎo)致血液的凝固和血栓的形成，即對(duì)材料的抗凝血性都有一定的要求[1-3]。因而，如何提高生物醫(yī)用材料的抗凝血性是內(nèi)植性高分子生物材料較為活躍的一個(gè)研究領(lǐng)域。

絲素蛋白是一種天然蛋白質(zhì)，因其良好的機(jī)械性能、生物相容性和易于加工等特點(diǎn)，在組織工程材料中得到越來(lái)越廣泛的研究與應(yīng)用[4]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外以絲素蛋白為素材，開(kāi)展了抗凝血?jiǎng)┖涂鼓牧系难芯縖2-3]。本文擬對(duì)改性絲素蛋白作為抗凝血材料的抗凝血機(jī)理、制備方法及其研究新進(jìn)展進(jìn)行概述。

1 改性絲素抗凝血材料研究進(jìn)展

1.1 硫酸化絲素

通過(guò)對(duì)絲素蛋白的結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，絲素包含有三類(lèi)蛋白:重鏈蛋白(H-鏈，350 kDa)、輕鏈蛋白(L-鏈，25 kDa)和P25蛋白(30 kDa)。這三類(lèi)蛋白的比例是H-鏈∶L-鏈∶P25=6∶6∶1。在H-鏈蛋白中主要是Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser這樣的氨基酸排列[5]，其中Ser之間的距離，與目前廣泛使用的抗凝素—肝素中有抗凝血作用的重要基團(tuán)硫酸基的距離十分相近。對(duì)肝素抗凝作用機(jī)制的研究表明，肝素類(lèi)藥物本身不具有直接的活性，其抗凝作用在于肝素分子中的葡糖胺單元中含-NH-SO3-基團(tuán)，該基團(tuán)可與抗凝血酶(antithrombin，ATIII)特異地結(jié)合，從而使抗凝血酶的構(gòu)型發(fā)生改變，暴露出活性中心，使血漿中的凝血因子IIa(凝血酶)，IXa，Xa，XIa和XIIa等失去活性[6]。因此，在其他材料中構(gòu)建類(lèi)似的結(jié)構(gòu)或引入-NH-SO3-基團(tuán)，該材料就具備抗凝血功能。研究表明，在其他材料中引入硫酸根或磺酸基團(tuán)，可以不同程度的改善材料的抗凝血性[7-8]。因此，若能在絲素蛋白Ser殘基上引入硫酸基或磺酸基，制造出類(lèi)似肝素的結(jié)構(gòu)，則可賦予絲素抗凝血作用。

日本科學(xué)家[9]的研究工作證實(shí)了這一點(diǎn)。用濃硫酸在一定溫度下處理絲素水溶液一定時(shí)間，用NaOH中和后，將硫酸化的絲素溶液透析脫鹽，經(jīng)冷凍干燥后得到硫酸化絲素粉。用傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜檢測(cè)硫酸處理的絲素被導(dǎo)入硫酸基的情況，結(jié)果表明絲素蛋白分子中的酪氨酸或絲氨酸的羥基被硫酸酯化，形成的硫酸酯基在1100～1400 cm-1處有強(qiáng)烈吸收峰，說(shuō)明絲素蛋白中被導(dǎo)入了硫酸基。將抽出的血液注入試管，在5 min內(nèi)，血液就自動(dòng)凝結(jié)，而在添加了硫酸化絲素粉的試管中的血液，即使經(jīng)過(guò)2 h以上，也不產(chǎn)生凝固反應(yīng)，從而說(shuō)明了硫酸化絲素蛋白可以使血液的凝固時(shí)間延長(zhǎng)，但較肝素的抗凝活性低。

為了提高硫酸化絲素的抗凝性，日本的Tamada Y.用氯磺酸代替硫酸進(jìn)行了硫酸化絲素蛋白的制備，并對(duì)其凝血性能進(jìn)行了測(cè)試[7，10]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用氯磺酸代替硫酸制備的硫酸化絲素，其抗凝活性提高了100倍。但是即便如此，它的活性仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及肝素。通過(guò)Tamada Y.的研究分析發(fā)現(xiàn)，絲素硫酸化接枝反應(yīng)主要發(fā)生在絲氨酸和酪氨酸殘基上。氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)硫酸化主要發(fā)生在H鏈，硫酸化絲素仍然保持絲素分子的結(jié)晶區(qū)。硫酸根接枝量隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，酸量滴定法測(cè)得其最大硫酸根接枝量為1.0 m mol/g，硫酸化效率為66.7%。進(jìn)一步的研究分析表明硫酸化絲素的抗凝血性主要取決于硫酸根量，表明硫酸根的引入導(dǎo)致了絲素蛋白的抗凝血。

除用氯磺酸硫酸化絲素外，李圣春等用吡啶三氧化硫硫酸化絲素，制備了水溶性的硫酸化絲素抗凝血材料，并對(duì)其抗凝血性能進(jìn)行了檢測(cè)[11]。結(jié)果表明，處理6h后含硫量達(dá)到最大值(1.26 m mol/g)，比 Tamada Y.報(bào)道的最大含硫量(1.0 m mol/g)高出25%。但遺憾的是，抗凝血效果依然不及肝素。以上研究表明，影響硫酸化絲素抗凝血性的關(guān)鍵在于硫酸根的接枝量，由于硫酸化接枝反應(yīng)主要發(fā)生在絲素蛋白分子中的絲氨酸和酪氨酸殘基上，而這兩種氨基酸在絲素中的含量只有25%左右，這是影響硫酸根和磺酸根接枝量，進(jìn)而影響抗凝效果的根本原因。

小直徑血管移植失敗的一個(gè)重要原因是其腔內(nèi)表面不能及時(shí)得到內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)流而容易形成血栓，如果支架能很好的抗凝血以等待血管細(xì)胞生長(zhǎng)形成光滑的腔內(nèi)表面將有望解決上述問(wèn)題。Haifeng Liu利用靜電紡絲技術(shù)將氯磺酸處理過(guò)的絲素蛋白制成絲素納米支架[12]，其抗凝血性和相容性的體外評(píng)價(jià)結(jié)果表明，硫酸化納米絲素支架的抗凝血性顯著增強(qiáng)，血管細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞ECs和平滑肌細(xì)胞SMCs)對(duì)該支架顯示出很強(qiáng)的粘附能力且增殖良好，這對(duì)血管組織的成功重建意義重大。

自然界除桑蠶(因家蠶取食桑葉稱(chēng)為桑蠶)外，還有很多非桑蠶也吐絲營(yíng)繭，如取食柞樹(shù)葉的柞蠶(Antherea pernyi)，取食蓖麻葉的蓖麻蠶(Philosamia cynthiaricini Boisduval)，以殼斗科柞屬植物的葉為食的天蠶(Antheraea yamamai Guerin-Meneville)和取食楠木葉的琥珀蠶(Antheraea Assama)等。這些非桑蠶的繭和絲和桑蠶繭絲具有相似的性質(zhì)和用途，因而受到廣泛的關(guān)注和研究。Kasoju，N等用琥珀蠶絲絲素作為基材制作了功能支架，并對(duì)支架表面進(jìn)行硫化修飾以期改善材料的血液相容性。掃描電鏡(SEM)結(jié)果顯示硫化對(duì)支架的架構(gòu)沒(méi)有影響，熱重分析(TGA)和親水性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明支架的熱穩(wěn)定性和親水性得到增強(qiáng);體外溶血實(shí)驗(yàn)，蛋白吸附和血小板粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該支架的血液相容性明顯改善;體外細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果表明該支架無(wú)毒，可支持細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)[13]。

1.2 中藥活性成分改性絲素

川芎嗪，化學(xué)名為2，3，5，6-四甲基吡嗪(TMP)，是活血化淤中草藥川芎的主要有效成份之一，現(xiàn)在已可人工合成。臨床治療及藥理研究表明川芎嗪具有改善微循環(huán)、抑制血小板聚集、防止血栓形成等作用，并且從上世紀(jì)70年代起已成為國(guó)內(nèi)臨床治療心腦血管病的常用藥物。連小潔等嘗試用川芎嗪及其衍生物對(duì)絲素進(jìn)行改性。首先在川芎嗪的側(cè)鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾引入活性基團(tuán)羥基，然后通過(guò)酯化反應(yīng)引入雙鍵，將得到的中間體進(jìn)一步在無(wú)引發(fā)劑條件下接枝聚合在絲素材料表面。結(jié)果表明，和未改性絲素相比，改性后的絲素部分凝血活酶時(shí)間(APT T)延長(zhǎng)，同時(shí)在富血小板血漿中培養(yǎng)30min后未發(fā)現(xiàn)有粘附的血小板，說(shuō)明川芎嗪衍生物改性絲素材料的體外抗凝血活性有所改善[14]。她還將川芎嗪結(jié)構(gòu)修飾得到的化合物接枝到聚丙烯酸(PAA)上，提高其穩(wěn)定性，然后與絲素共混制備共混膜，結(jié)果同樣獲得了抗凝效果不錯(cuò)的抗凝血材料[15]。

Song W.等將原兒茶醛(活血化瘀中草藥丹參的主要活性成分)接枝聚合在絲素蛋白表面，結(jié)果表明改性后的絲素蛋白材料抗凝血性能有了明顯提高，而且細(xì)胞親和力得到增強(qiáng)[16]。利用活血化瘀中草藥的活性成分對(duì)絲素蛋白進(jìn)行改性修飾以其提高其抗凝血性的方法，為我們?cè)诳鼓z素材料的研究上提出了新的思路。但中草藥改性絲素抗凝血材料的抗凝血原理和抗凝機(jī)制目前還未見(jiàn)報(bào)道。

1.3 肝素化絲素抗凝血材料

肝素本為抗凝血?jiǎng)?，將肝素固定在絲素材料表面或混入絲素中對(duì)絲素進(jìn)行改性，可制備抗凝血材料。馮桂龍等以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(簡(jiǎn)稱(chēng)EDCI)為縮合劑對(duì)改性絲素/膠原膜進(jìn)行了肝素固定化，肝素固定化的絲素改性膠原膜具有良好的抗凝血性[17]。程忠玲選用酶法制備的膠原與肝素化膠原共混，采用戊二醛作為交聯(lián)劑，在25℃、相對(duì)濕度為65%的環(huán)境下干燥72 h，制備了肝素化膠原/絲素共混膜。共混膜的活化部分凝血活酶時(shí)間(APT T)、凝血酶時(shí)間(TT)、凝血酶原時(shí)間(PT)分別超過(guò)150s、200s、50s[18]。葉勇等利用等離子體處理技術(shù)使絲素膜表面被激活，以戊二醛作為交聯(lián)劑，接枝肝素分子進(jìn)行絲素膜表面抗凝血性修飾。單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:經(jīng)等離子體和戊二醛處理后的絲素膜與肝素溶液的較好反應(yīng)條件為pH 1.5、40℃、4 h，該條件下絲素膜表面肝素含量為37.62μ g/g。經(jīng)體外凝血試驗(yàn)檢測(cè)，接枝肝素分子后的絲素膜具有較強(qiáng)的抗凝血活性;經(jīng)穩(wěn)定性試驗(yàn)分析，肝素與絲素膜結(jié)合穩(wěn)定牢固不易被洗脫，提示其結(jié)合方式為共價(jià)鍵結(jié)合[19]。

除純絲素肝素固定化外，絲素共混材料的肝素共混和固定化也可制備抗凝血材料。She等將肝素在溫和的條件下加入絲素/殼聚糖支架中。各種分析結(jié)果表明，加了肝素的絲素/殼聚糖支架維持了絲素基材支架的多孔性和良好的機(jī)械性能，并有效增強(qiáng)了其抗凝性，導(dǎo)致支架可以與血液兼容[20]。為控制肝素的釋放，延長(zhǎng)材料的抗凝血作用時(shí)間，Xiu-Ying Liu等在聚氨酯和絲素蛋白共混膜中載入肝素制備了肝素緩釋體系。該體系中，肝素的釋放率和累計(jì)釋放比例可由膜上載入的肝素量，絲素蛋白與聚氨酯的組成比例以及膜厚度來(lái)控制。增加膜厚度，提高肝素載入數(shù)量及提高膜中的絲素蛋白量可以更慢更持久的釋放肝素。復(fù)合膜保持了肝素高的生物活性和持久的抗凝血酶時(shí)間，凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)表明該復(fù)合薄膜具有良好的血液相容性[21]。

Shudong Wang等利用靜電紡絲技術(shù)制備了兩種靜電紡肝素改性絲素納米材料，體外凝血測(cè)試結(jié)果表明該絲素納米材料的抗凝血性遠(yuǎn)高于純絲素。此外，L929成纖維細(xì)胞和EVCs在肝素改性絲素納米材料上的擴(kuò)展增殖好于純絲素材料，而且未觀察到巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，表明該材料在機(jī)體內(nèi)不會(huì)引起嚴(yán)重的炎癥[22]。

1.4 接枝2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽酰的絲素蛋白材料

Furuzono等用2-甲基丙烯酰氧乙基異氰酸酯的乙烯基對(duì)絲素進(jìn)行改性，然后采用偶氮聚合引發(fā)劑將其接枝在改性的絲素上。接枝2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽酰的高分子材料具有類(lèi)磷脂結(jié)構(gòu)，其表面可強(qiáng)烈吸附血液中的磷脂分子，在材料表面形成單層完全覆蓋的類(lèi)似生物體表面的磷脂層，使血漿蛋白和血細(xì)胞與材料表面的相互作用變?nèi)酰瑥亩行б种撇牧媳砻娴难獫{蛋白吸附、血小板黏附以及血小板的活化，阻礙血栓的發(fā)生。體外血小板黏附實(shí)驗(yàn)證實(shí)，接枝2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽酰的絲素比對(duì)照絲素的血小板黏附顯著降低。同時(shí)發(fā)現(xiàn)接枝率在6.9%，17.2%和26.3%的絲素三者之間的血小板黏附數(shù)量并無(wú)顯著性差異，說(shuō)明在所研究的范圍內(nèi)血小板黏附數(shù)量與2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽酰接枝到絲素上的數(shù)量沒(méi)有關(guān)系[23]。

1.5 接枝褐藻多糖硫酸酯的絲素蛋白材料

褐藻多糖硫酸酯是從褐藻中分離出的一種獨(dú)特種類(lèi)的硫酸基多糖，是目前除肝素外研究較多的有效抗凝血?jiǎng)┲?。程忠玲等利用等離子體技術(shù)在其表面上接上氨基，采用戊二醛為交聯(lián)劑，將褐藻多糖硫酸酯固定在絲素膜的表面上?？鼓钚栽u(píng)價(jià)結(jié)果表明:改性絲素膜的APT T和TT比未處理的純絲素膜、NH3等離子體處理絲素膜分別延長(zhǎng)35s和4s[24]。利用X射線電子能譜進(jìn)行絲素蛋白膜表面元素分析，發(fā)現(xiàn)APT T、T T隨著改性絲素膜表面硫含量的增加而增加，說(shuō)明接枝膜的抗凝血活性依賴(lài)于其表面的抗凝血?jiǎng)┑牧蛩岣縖25]。褐藻多糖硫酸酯是利用其帶有的硫酸基等負(fù)電荷基團(tuán)與HCⅡ結(jié)合，而形成的復(fù)合物又與凝血酶結(jié)合，從而在空間結(jié)構(gòu)上阻礙了凝血酶的活性。同時(shí)褐藻多糖硫酸酯也結(jié)合在纖維蛋白原的堿性氨基酸殘基如精氨酸或賴(lài)氨酸上，使凝血酶無(wú)法接近并作用于纖維蛋白原，因此，抗凝血主要是增強(qiáng)HCⅡ?qū)δ富钚缘囊种坪鸵种评w維蛋白原的凝結(jié)來(lái)延長(zhǎng)凝血時(shí)間[26]。

1.6 磺酸化絲素

顧晉偉等首次采用二氧化硫等離子體處理絲素薄膜，在其表面引入磺酸基團(tuán);同時(shí)用氨氣等離子體處理絲素蛋白膜后在表面接入氨基，利用1，3-丙磺酸內(nèi)酯與氨基的反應(yīng)在材料表面接枝磺酸基團(tuán)。X射線電子能譜的分析結(jié)果表明，絲素膜表面僅有微量的硫元素(0.32%)，經(jīng)過(guò)二氧化硫等離子體處理后絲素膜表面的硫元素含量上升到4.03%。全反射紅外光譜在1 160 cm-1附近出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰，歸于磺酸基團(tuán)-SO3H中S=O鍵的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)。體外抗凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，APT T和T T分別超過(guò)150 s和90 s，而PT變化不大，表明材料表面接入的磺酸基團(tuán)與部分凝血活酶時(shí)間所涉及的凝血因子產(chǎn)生相互作用，從而抑制其中的凝血因子的活性，而且對(duì)纖維蛋白原也有相當(dāng)?shù)囊种谱饔茫Y(jié)果表明二氧化硫等離子體改性的絲素蛋白材料在抗凝血性方面具有優(yōu)越的性能[27]。

在實(shí)用化的醫(yī)學(xué)組織工程方面，李少彬等采用低溫等離子體技術(shù)處理普通聚四氟乙烯人工血管內(nèi)表面，將制備并濃縮到一定濃度的絲素蛋白溶液均勻涂覆到人工血管內(nèi)表面，再次使用低溫等離子體技術(shù)對(duì)人工血管內(nèi)表面的絲素膜進(jìn)行磺酸化處理。以普通聚四氟乙烯人工血管為對(duì)照，進(jìn)行接觸角及磺酸化效果檢測(cè)。結(jié)果表明:氬氣低溫等離子體處理前后接觸角分別為87.7°和65.1°，涂覆絲素蛋白后接觸角為106.2°，二氧化硫低溫等離子體處理后接觸角為92.9°;X射線光電子能譜儀檢測(cè)對(duì)照絲素膜表面僅有微量的硫元素(0.12%)存在，經(jīng)過(guò)二氧化硫等離子體處理后絲素表面的硫元素含量上升到2.89%;X射線光電子能譜圖中的S2p峰擬合曲線顯示了復(fù)合血管表面的S原子主要是磺酸基團(tuán)(-SO3H)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)已制備出理論上具有抗凝血性能的血管[6]。

2 展望

綜上所述，通過(guò)對(duì)絲素蛋白進(jìn)行各種修飾改性，可以使本身不具有抗凝血效果的絲素蛋白獲得抗凝血性，這大大提高了絲素在組織工程材料方面的應(yīng)用潛力和價(jià)值。部分研究已將其應(yīng)用在人工血管的制備上[6，12]，血液相容性和適應(yīng)性良好，為絲素抗凝血組織工程材料的進(jìn)一步應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。但是，血液凝固機(jī)制十分復(fù)雜，改性絲素該凝血材料的抗凝血機(jī)理，以及抗凝材料表面微觀結(jié)構(gòu)與抗凝血性之間關(guān)系的研究還很不完善，尚需進(jìn)一步研究。隨著抗凝血機(jī)制和改性方法的深入研究，相信絲素蛋白材料在抗凝血?jiǎng)┖涂鼓牧项I(lǐng)域?qū)⒂泻艽蟮膽?yīng)用潛力。

[1]林思聰.高分子生物材料分子工程研究進(jìn)展[J].高分子通報(bào)，1997，1:1.

[2]程忠玲，邵建明.抗凝血絲素蛋白材料的研究進(jìn)展[J].材料導(dǎo)報(bào)，2005，19(11):363-365.

[3]程忠玲，邵建明.絲素蛋白作為抗凝血材料的研究與進(jìn)展[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11(18):3621-3624.

[4]侯春春，張胡靜，李圣春，等.蠶絲蛋白生物醫(yī)學(xué)材料的研究現(xiàn)狀[J].絲綢，2010，(07):18-22.

[5]John G.Hardy，Thomas R.Scheibel.Composite materials based on silk proteins[J].Progress in Polymer Science，2010，35(9):1093-1115.

[6]李少彬，閆玉生，李輝，等.等離子體磺酸化絲素蛋白膜聚四氟乙烯復(fù)合小口徑人工血管的制備[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14(8):1357-1360.

[7]尹桂波譯.氯磺酸對(duì)絲素的硫酸化及其抗凝性[J].國(guó)外絲綢，2004，19(2):16-19，15.

[8]Jun-ichi Takahara，Kayo Hosoya，Michihiro Sunako，etc.Anticoagulant activity of enzymatically synthesized amylose derivatives containing carboxy or sulfonate groups[J].Acta Biomaterialia，2010，6(8):3138-3145.

[9]周耀祖譯.蠶絲在醫(yī)藥領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)利用[J].蠶桑通報(bào)，1998，29(3):62.

[10]Tamada Y.Sulfation of silk fibroin by chlorosulfonic acid and the anticoagulant activity[J].Biomaterials，2004，25(3):377-383.

[11]李圣春，侯春春，徐水.采用吡啶三氧化硫制備硫酸化絲素及其抗凝血性能檢測(cè)[J].蠶業(yè)科學(xué)，2010，36(3):0533-0557.

[12]Haifeng Liu，Xiaoming Li，Gang Zhou，etc.Electrospun sulfated silk fibroin nanofibrous scaffolds for vascular tissue engineering[J].Biomaterials，2011，32(15):3784-3793.

[13]Kasoju N，Bora U.Antheraea assama silk fibroin-based functional scaffold with enhanced blood compatibility for tissue engineering applications[J].Advanced Engineering Materials，2010，12(5):139-147.

[14]連小潔，王松，朱鶴孫.川芎嗪衍生物改性絲素材料體外抗凝血性研究[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(工學(xué)版)，2009，30(1):134-138.

[15]Xiaojie Lian，Song Wang，Guoliang Xu，etc.The application with tetramethyl pyrazine for antithrombogenicity improvement on silk fibroin surface[J].Applied Surface Science，2008，255(2):480-482.

[16]Song Wang，Zhen Gao，Erlin Li，etc.The application with protocatechualdehyde to improve anticoagu-lant activity and cell affinity of silk fibroin[J].Applied Surface Science，2008，255(2):486-488.

[17]馮桂龍，王松，朱鶴孫.絲素改性膠原膜的肝素化及其體外抗凝血性能評(píng)價(jià)[J].功能材料，2005，36(1):150-152.

[18]程忠玲.肝素化膠原/絲素共混膜的制備及其抗凝血性能[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11(1):11-13.

[19]葉勇，張劍韻，黃龍全.絲素膜表面接枝肝素分子的反應(yīng)條件與體外抗凝血作用[J].蠶業(yè)科學(xué)，2007，33(1):74-78.

[20]She ZD，Liu WQ，F(xiàn)eng QL.Silk fibroin/chitosan/heparin scaffold:preparation，antithrombogenicity and culture with hepatocytes[J].Polymer International，2010，59(1):55-61.

[21]Xiu-Ying Liu，Chao-Can Zhang，Wei-Lin Xu，etc.Controlled release of heparin from blended polyurethane and silk fibroin film[J].Materials Letters.2009，63:263-265.

[22]Shudong Wang，Youzhu Zhang，Hongwei Wang，etc.Preparation，characterization and biocompatibility of electrospinning heparin-modified silk fibroin nanofibers[J].International Journal of Biological Macromolecules，2011，48(2):345-53.

[23]Furuzono T，Ishihara K，Nakabayashi N，etc.Chemical modification of silk fibroin with 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine.II.Graft-polymerization onto fabric through 2-methacryloyloxyethyl is ocyanate and interaction between fabric and platelets[J].Biomaterials，2000，21(4):327-333.

[24]程忠玲，王松.絲素膜上接枝褐藻多糖硫酸酯及其體外抗凝血性能的研究[J].精細(xì)化工，2004，21(4):282-284.

[25]程忠玲，王松，王青華，等.絲素蛋白膜上褐藻糖膠的固定化及其體外抗凝血性能[J].中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào)，2005，24(5):602-605.

[26]鄭軍，夏明.褐藻糖膠抗血栓研究進(jìn)展[J].中國(guó)海洋藥物，2002，21(2):53-59.

[27]顧晉偉，楊新林，王俐勇，等.絲素蛋白膜表面的等離子體磺酸化及體外抗凝血性能[J].高技術(shù)通訊，2001，12(8):7-10.