蛋白基因產(chǎn)物9.5和泛素在IgA腎病中的表達(dá)

賈寧 王漢 彭莉

蛋白基因產(chǎn)物9.5和泛素在IgA腎病中的表達(dá)

賈寧 王漢 彭莉

目的觀察蛋白基因產(chǎn)物9.5(PGP 9.5)和泛素(ubiquitin)在IgA腎病(IgAN)患者腎組織的表達(dá)及其與臨床病理的關(guān)系，探討其在IgAN病變的作用。方法53例IgAN患者分為單純血尿組(A組)及混合蛋白尿、血尿組(B組)，免疫組織化學(xué)和免疫雙染色法觀察PGP 9.5和泛素在IgAN腎組織中的表達(dá)。結(jié)果免疫組織化學(xué)顯示在IgAN腎組織中，PGP 9.5和泛素均有表達(dá)，主要在上皮細(xì)胞(壁上皮細(xì)胞、特別是小管上皮細(xì)胞)及新月體表達(dá)。免疫組化雙染色顯示:泛素分布更廣泛，PGP 9.5表達(dá)比泛素表達(dá)稍強(qiáng)，按Lee氏分級(jí)的級(jí)別增加逐漸增高，免疫組織化學(xué)半定量評(píng)分顯示增生肥厚病變部位及新月體表達(dá)明顯強(qiáng)于正常和纖維化/萎縮的部位(P＜0.01)，PGP 9.5及泛素的表達(dá)與患者24 h尿蛋白定量及病理分級(jí)成正相關(guān)。結(jié)論P(yáng)GP 9.5及泛素可能在IgAN病變及進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用。

IgA腎病;蛋白基因產(chǎn)物9.5;泛素;24 h蛋白尿

IgA腎病(IgAN)是臨床常見的原發(fā)性腎小球疾病，其發(fā)病機(jī)制迄今尚未明了，本研究擬檢測(cè)PGP 9.5和泛素在IgAN腎組織中的表達(dá)情況及與臨床病理的關(guān)系，探討其在IgAN病變中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2001年7月至2004年10月在我科經(jīng)臨床和腎活檢/光鏡、免疫熒光證實(shí)為IgAN的患者共53例其中小管間質(zhì)損害占96.23%，同時(shí)排除過敏性紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性肝病等引起的的繼發(fā)性IgAN。所有患者腎功能正常，血壓正常。其中男22例，女31例，年齡14～54歲，病程1周～13年。臨床表現(xiàn)為單純血尿組21例(A組)，混合蛋白尿、血尿組32例(B組)，此兩組患者在年齡、性別、病程構(gòu)成比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 病理損害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)IgAN腎臟病變損害程度組織學(xué)分級(jí)采用Lee［1］修改的Meadow組織學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。Ⅰ級(jí):基本正常，偶見輕度系膜增寬伴有或不伴有系膜細(xì)胞增多，無腎小管間質(zhì)損害;Ⅱ級(jí):＜50%腎小球可見有系膜細(xì)胞增生和硬化，無腎小管間質(zhì)損害;Ⅲ級(jí):局灶或彌漫的腎小球系膜基質(zhì)增寬及細(xì)胞增生，偶有球囊黏連和小新月體形成，偶有局灶間質(zhì)水腫和輕度的炎細(xì)胞浸潤(rùn);Ⅳ級(jí):全部腎小球均有彌漫性的系膜增生和硬化，可見廢棄的腎小球，＜45%的腎小球有球囊黏連和新月體形成，有明顯腎小管萎縮和間質(zhì)炎癥;Ⅴ級(jí):較Ⅳ型方法更為嚴(yán)重，出現(xiàn)腎小球節(jié)段和/(或)球性硬化、透明樣變性、球囊黏連，＞50%的腎小球有新月體形成，腎小管及間質(zhì)損害較Ⅳ級(jí)更為嚴(yán)重。腎小管、腎間質(zhì)及血管病變的各項(xiàng)病變參數(shù)，采用Katafuchi等［2］的半定量標(biāo)準(zhǔn)。腎小管、腎間質(zhì)及血管病變積分0～12分，包括間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮、血管壁增厚或透明變性;積分評(píng)定分別是:無，0分;＜25%，1分;26%～50%，2分;＞51%，3分。

1.3 標(biāo)本處理全部標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切4 mm厚切片，常規(guī)行PAS、HE、PASE及Masson染色.常規(guī)光鏡下觀察。

1.3.1 免疫組織化學(xué)檢查石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，10%正常山羊血清封閉。用1:100稀釋的多克隆小鼠抗人PGP 9.5抗體(Chemicon公司)，1:100單克隆小鼠抗人泛素抗體(Chemicon公司)37℃孵育，生物素偶聯(lián)的羊抗鼠或兔抗羊工作液37℃孵育，辣根過氧化物酶偶聯(lián)的鏈霉卵白素37℃孵育，以DAB和雙氧水室溫發(fā)色8 min。以PBS液替代一抗為陰性對(duì)照。免疫組化雙染色按試劑盒進(jìn)行(Dako公司)。

1.3.2 腎組織PGP 9.5和泛素免疫組化表達(dá)半定量分析方法根據(jù)染色強(qiáng)度分為0～3級(jí)，0級(jí)為陰性，1級(jí)為淡黃色，2級(jí)為棕黃色，3級(jí)為棕褐色;根據(jù)染色面積分為0～3級(jí)，0級(jí)為無染色，1級(jí)染色面積＜25%，2級(jí)為25%～50%，3級(jí)為＞50%。計(jì)算強(qiáng)度與面積積分的乘積進(jìn)行分析表較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)雙染色顯示Lee分級(jí)不同級(jí)別腎組織中PGP 9.5和泛素表達(dá)的情況:在正常的腎組織中，可見到PGP 9.5和泛素均有表達(dá)，特別是腎小管上皮細(xì)胞，Bowman's囊可見少量陽性表達(dá)，系膜細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞無表達(dá)。IgAN腎組織中，PGP 9.5和泛素表達(dá)在Ⅴ級(jí)病理損害時(shí)最高，按Lee分級(jí)的級(jí)別加重逐漸增高(P＜0.05)。

2.2 不同臨床表現(xiàn)患者PGP 9.5和泛素表達(dá)的情況:A組(21例)PGP 9.5評(píng)分(2.30±0.31)分;Ubiquitin評(píng)分(1.90 ±0.16)分。B組(32例)PGP 9.5評(píng)分(3.00±0.22);Ubiquitin評(píng)分(2.80±0.41)分與單純性血尿患者(A組)相比，混合蛋白尿、血尿患者(B組)PGP 9.5和泛素表達(dá)明顯增高(與A組比較，P＜0.05)。

2.3 免疫組織化學(xué)雙染色顯示高倍鏡下可見腎小管PGP 9.5和泛素表達(dá)，泛素分布更廣泛，PGP 9.5表達(dá)比泛素表達(dá)表較稍強(qiáng)。

2.4 免疫組織化學(xué)半定量評(píng)分顯示增生肥厚病變部位PGP 9.5評(píng)分(2.90±0.17)分;Ubiquitin評(píng)分(2.40±0.20)分。正常部位PGP 9.5評(píng)分(1.90±0.41)分;Ubiquitin評(píng)分(1.80±0.18)分。纖維化/萎縮的部位PGP 9.5評(píng)分(0.60± 0.39)分;Ubiquitin評(píng)分(0.50±0.30)分。增生肥厚病變部位明顯強(qiáng)于正常和纖維化/萎縮的部位(P＜0.05，P＜0.01)。

2.5 IgAN表現(xiàn)為新月體腎炎，PGPG9.5和泛素表達(dá)呈強(qiáng)陽性。

2.6 PGP 9.5和泛素表達(dá)與IgAN臨床病理特征的相關(guān)性: PGP 9.5和泛素表達(dá)與患者病理分級(jí)成顯著正相關(guān)(r= 0.663，P＜0.01)，與24 h尿蛋白定量成正相關(guān)(r=0.406，P＜0.05)。

3 討論

PGP 9.5屬于泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中去泛素化酶家族中激酶，分子量27KD，是可溶性蛋白，在細(xì)胞內(nèi)蛋白水解過程中起調(diào)節(jié)作用，他與泛素羧基末端相連，當(dāng)泛素標(biāo)記的目的蛋白被泛素系統(tǒng)降解后，PGP 9.5使底物泛素水解、游離出來再循環(huán)重復(fù)使用，避免泛素本身被蛋白酶體系統(tǒng)水解［3］。細(xì)胞內(nèi)蛋白的降解是緊密的調(diào)節(jié)過程，對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)起重要作用。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)依賴ATP，非溶酶體途徑的蛋白降解通路，通過降解多種胞內(nèi)蛋白，參與細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化與調(diào)亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、免疫應(yīng)答及抗原呈遞等多種生命活動(dòng)［4］。

本研究發(fā)現(xiàn)PGP 9.5和其底物泛素在IgAN腎組織主要表達(dá)于上皮細(xì)胞，特別是腎小管上皮細(xì)胞，包蔓氏囊也有少量表達(dá)。這種表達(dá)可能與腎小管上皮細(xì)胞具有分泌、重吸收、及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)在活化的上皮細(xì)胞、增生肥厚的小管上皮細(xì)胞表達(dá)呈強(qiáng)陽性，而相反，在萎縮，損傷的上皮細(xì)胞中其表達(dá)明顯減弱，而且在新月體的表達(dá)明顯增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)隨著病理改變的加重，Lee分級(jí)的增加，雖然PGP 9.5及泛素在小管間質(zhì)纖維化中的表達(dá)減弱，但同時(shí)伴隨新月體形成增加PGP 9.5及泛素表達(dá)明顯增加。研究發(fā)現(xiàn)PGP 9.5通過控制某些細(xì)胞周期素抑制因子的水解，例如周期依賴激酶p27的抑制因子，從而誘導(dǎo)增強(qiáng)細(xì)胞的增殖［5-8］，在細(xì)胞周期中，細(xì)胞周期素(cyclin)和細(xì)胞周期素依賴性激酶(C'DKs)是正向調(diào)節(jié)因子，而CDK抑制因子(CKIs)～lJ起著負(fù)向調(diào)節(jié)作用，CKI可抑制許多不同的CDK復(fù)合物，主要抑制周期素E-CDK2和周期素D-CDK4等Gl期復(fù)合物，因此會(huì)抑制細(xì)胞周期中的正向調(diào)節(jié)因子，使細(xì)胞停滯在G1期，導(dǎo)致細(xì)胞肥大，細(xì)胞分裂減緩。這與作者的觀察結(jié)果是一致的。

蛋白尿的多少是IgAN預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，本研究中，有蛋白尿的患者與單純血尿患者相比，PGP 9.5及泛素表達(dá)顯著增強(qiáng)，這提示:PGP 9.5、泛素甚至整個(gè)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)可能在IgAN病程中對(duì)上調(diào)增殖起基本作用，并可能在病變由細(xì)胞活化、增生、肥厚等急性病變向纖維化、萎縮等慢性病變過程中起調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)PGP 9.5和泛素在系膜細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)陰性，這可能是由于這些細(xì)胞的調(diào)節(jié)是受其他通路控制的，例如MARK通路等［9］。

綜上所述，PGP 9.5及泛素可能在IgAN病變及進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用，但是其只是在IgAN中起作用還是否在其他腎臟疾病的病變中也起相同的作用，還需進(jìn)一步觀察研究。

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Expression of protein gene product 9.5 and ubiquitin in IgA nephropathy

JIA Ning，WANG Han，PENGLi．Department of Nephrology，The Fifth Affiliated Hospital，Sun Yet-Sen University，Zhuhai 519000，China

ObjectiveTo explore the expression of protein gene product 9.5(PGP 9.5)and ubiquitin in the renal tissue of patients with IgA nephropathy，to study the role of protein gene product 9.5 and ubiquitin on IgA nephropathy and relationship between PGP 9.5，ubiquitin express and clinicopathologicol features of I gAN.MethodsImmunohistochemistry and double stain were applied to detect the expression of protein gene product 9.5 and ubiquitin in 53IgA nephropathy patients．ResultsImmunohistochemistry showed PGP 9.5 and ubiquitin were expressed in IgAN，especial in epithelial cells and crescentic，with the strongest positivity in hypertophic condition and weak positivity in atrophic condition was correlated(P＜0.01)，the expression of PGP 9.5 and ubiquitin protein in IgAN was correlated with pathological grading，24 hours urineproteins.ConclusionPGP 9.5 and ubiquitin may play an important role in IgAN．

IgAN;PGP 9.5;Ubiquitin;24-hours urineprotein

519000珠海，中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院腎內(nèi)科(賈寧彭莉)，神經(jīng)外科(王漢)