ELISA法檢測獻(xiàn)血者HBsAg應(yīng)用分析

閆曉鵬 王林 張國平

ELISA法檢測獻(xiàn)血者HBsAg應(yīng)用分析

閆曉鵬 王林 張國平

目的探討酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)在獻(xiàn)血者HBsAg檢測中的應(yīng)用、影響因素及解決方法。方法利用ELISA法，對無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本進(jìn)行HBsAg初檢、復(fù)檢兩次檢測;實(shí)驗(yàn)結(jié)果0.7≤s/co＜1的標(biāo)本，使用原試劑進(jìn)行雙孔復(fù)試。結(jié)果13796份血液標(biāo)本，HBsAg陽性共24份;0.7≤s/co＜1的標(biāo)本57份，經(jīng)雙孔復(fù)試，陽性標(biāo)本2份。結(jié)論應(yīng)重視OD值接近臨界值標(biāo)本的復(fù)核工作;加強(qiáng)對血液標(biāo)本、儀器設(shè)備及檢測試劑的質(zhì)量管理，規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作，提高重復(fù)性;建議生產(chǎn)二步法試劑，避免產(chǎn)生高值鉤狀效應(yīng)，提高血液安全水平。

ELISA;HBsAg

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是三大免疫標(biāo)記技術(shù)之一，具有靈敏度高、特異性好、操作簡便、技術(shù)可靠、試劑穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，是目前采供血機(jī)構(gòu)對獻(xiàn)血者進(jìn)行乙型肝炎表面抗原(HB-sAg)檢測的主要方法［1］。筆者對ELISA法在獻(xiàn)血者HBsAg檢測中的應(yīng)用、影響因素及解決方法進(jìn)行了分析總結(jié)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年1月至2010年6月本站無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本13796份。獻(xiàn)血者獻(xiàn)血前，均常規(guī)使用HBsAg金標(biāo)試紙條進(jìn)行初篩，結(jié)果陰性者方可獻(xiàn)血。每位獻(xiàn)血者均留取2份血液標(biāo)本，其中1份為獻(xiàn)血者獻(xiàn)血時(shí)采血時(shí)留取的試管標(biāo)本，作為初檢標(biāo)本;另1份為留取血袋上的導(dǎo)管血標(biāo)本，作為復(fù)檢標(biāo)本。

1.2 試劑 初檢HBsAg試劑盒由北京現(xiàn)代高達(dá)生物藥業(yè)有限公司提供;復(fù)檢HBsAg試劑盒由北京萬泰生物技術(shù)有限公司提供。以上試劑均經(jīng)中國藥品生物制品檢定所批檢合格，在有效期內(nèi)使用。

1.3 質(zhì)控血清 HBsAg含量為2NCU/ml，北京康徹斯坦公司提供，在有效期內(nèi)使用。

1.4 主要儀器 STAR全自動(dòng)樣本處理系統(tǒng)(瑞士HAMILTON公司);Xantus全自動(dòng)樣本處理系統(tǒng)(瑞士Sias公司);FAME全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)(瑞士HAMILTON公司);SUNRISE酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司);Columbus洗板機(jī)(瑞士TECAN公司);MK2洗板機(jī)(芬蘭Thermo公司)。

1.5 方法 所有無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本，均使用ELISA法進(jìn)行初檢、復(fù)檢兩次檢測。按照試劑使用說明書要求，在STAR全自動(dòng)樣本處理系統(tǒng)及Xantus全自動(dòng)樣本處理系統(tǒng)控制微機(jī)上編寫加樣程序。加樣過程中，全自動(dòng)加樣系統(tǒng)在吸取、分配不同的血液標(biāo)本或液體試劑后，按設(shè)定程序自動(dòng)清洗加樣探針。加樣程序完成后，分別將微板移至FAME全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)，進(jìn)行溫育、洗板、顯色、結(jié)果判讀。實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陽性的標(biāo)本，使用金標(biāo)試紙條重新檢測一次;0.7≤s/co＜1的標(biāo)本，使用原試劑進(jìn)行雙孔復(fù)試。

2 結(jié)果

13796份血液標(biāo)本，HBsAg陽性共24份。其中，s/co≥6的陽性標(biāo)本11份，金標(biāo)試紙條重新檢測均呈陽性;s/co＜6的陽性標(biāo)本13份，金標(biāo)試紙條重新檢測有3份為陽性，10份為陰性。實(shí)驗(yàn)過程中，共發(fā)現(xiàn)0.7≤s/co＜1的標(biāo)本57份，經(jīng)雙孔復(fù)試，陽性標(biāo)本2份。

3 討論

ELISA法HBsAg試劑的靈敏度明顯優(yōu)于金標(biāo)法［2］，在上述實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)。因此，盡管獻(xiàn)血者經(jīng)過了金標(biāo)法初篩，在實(shí)驗(yàn)室對血液標(biāo)本進(jìn)行初復(fù)檢檢測時(shí)，還應(yīng)認(rèn)真對待，不可麻痹大意。還須重視OD值接近臨界值(cutoff)標(biāo)本的

［1］ 王培華.輸血技術(shù)學(xué).人民衛(wèi)生出版社，2002:106-108.

［2］ 唐廷茂，馮治偉.血漿金標(biāo)法快速篩查HBsAg在流動(dòng)采血中的應(yīng)用.臨床輸血與檢驗(yàn)，2004，6(4):282.

［3］ 中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司.全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程，第3版.南京:東南大學(xué)出版社，2006，311.

［4］ 賈杰.乙型肝炎表面抗原檢測的鉤狀效應(yīng).現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2005，32(5):496-498.

［5］ 李秋生，肖韶英，楊華文.乙型肝炎表面抗原檢測中假陰性問題探討.臨床輸血與檢驗(yàn)，2002，4(2):34-35.

454000河南省焦作市中心血站復(fù)核工作，在上述57份0.7≤s/co＜1的標(biāo)本中，經(jīng)雙孔復(fù)試有2份陽性，這些標(biāo)本一旦漏檢，將會給臨床輸血帶來極大危害。

在上述接近臨界值的標(biāo)本中，經(jīng)雙孔復(fù)試大部分為陰性，說明第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)有部分因素影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。筆者對影響因素進(jìn)行了分析，并采取了相應(yīng)對策，主要有以下幾個(gè)方面:①對血液標(biāo)本的采集與處理過程進(jìn)行質(zhì)量管理:應(yīng)避免溶血，血紅蛋白(Hb)具有過氧化物酶活性［3］，標(biāo)本中的Hb可催化底物而顯色;抗凝血液標(biāo)本應(yīng)抗凝良好，不抗凝標(biāo)本應(yīng)待血液完全凝固后，方可加樣，否則微孔內(nèi)非特異性吸附纖維蛋白而出現(xiàn)假陽性結(jié)果;②加強(qiáng)儀器設(shè)備管理:建立和實(shí)施儀器設(shè)備的維護(hù)、校準(zhǔn)和持續(xù)監(jiān)控管理制度;大型和關(guān)鍵儀器設(shè)備專人管理、專人使用制度;實(shí)驗(yàn)室所有儀器設(shè)備均使用不間斷電源供電(UPS);洗板機(jī)注液針、吸液針保持通暢;③試劑應(yīng)室溫平衡后使用:實(shí)驗(yàn)前將試劑置室溫平衡30～60 min，實(shí)驗(yàn)時(shí)微板可較快達(dá)到預(yù)設(shè)溫度，防止弱陽性標(biāo)本漏檢;④孵育:微板進(jìn)入孵浴箱后，溫度從室溫升至37℃需一定時(shí)間，應(yīng)依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室不同環(huán)境溫度下微板從室溫至孵育箱后達(dá)到預(yù)設(shè)溫度所需要時(shí)間的長短，確定在孵育箱中的孵育時(shí)間，以免導(dǎo)致弱陽性標(biāo)本漏檢;⑤洗板:應(yīng)按試劑說明書配制洗滌應(yīng)用液，并按要求次數(shù)洗板，次數(shù)過少或過多會導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果;手工洗板時(shí)應(yīng)注意液體被濺出，或孔與孔之間液體溢出，連成整體液面后易產(chǎn)生花板;⑥顯色:顯色劑盡量在臨用前配制，注意觀察TMB顯色劑外觀，變色及過期的顯色劑不能使用;顯色劑應(yīng)避免接觸金屬離子及次氯酸等化學(xué)物質(zhì)。通過采取以上措施，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性進(jìn)一步提高，取得了較為滿意的效果。

目前市場上的ELISA法HBsAg試劑盒多為雙抗體夾心一步法，該方法具有操作簡便、反應(yīng)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。但當(dāng)標(biāo)本中HBsAg濃度過高時(shí)，會因鉤狀效應(yīng)出現(xiàn)弱陽性甚至假陰性結(jié)果而造成漏檢，有報(bào)道漏檢率達(dá)0.49%［4］。二步法可解決高值鉤狀效應(yīng)問題［5］，因此建議生產(chǎn)廠家為臨床輸血安全考慮，生產(chǎn)二步法試劑以滿足對獻(xiàn)血者進(jìn)行嚴(yán)格檢測的需求，進(jìn)一步提高血液安全水平。