酶法降解殼聚糖及產(chǎn)物應用研究進展

竇 屾，廖永紅，楊春霞，任文雅，徐 瑾

(北京工商大學食品學院/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048)

酶法降解殼聚糖及產(chǎn)物應用研究進展

竇 屾，廖永紅*，楊春霞，任文雅，徐 瑾

(北京工商大學食品學院/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048)

殼聚糖是一種天然生物多糖，它來源于自然界中含量豐富的甲殼素。經(jīng)過降解后，低聚合度水溶性殼聚糖展現(xiàn)出優(yōu)良的生物活性。對利用專一性酶和非專一性酶制備低聚水溶性殼聚糖及其水解產(chǎn)物的應用進行了介紹，并且提出了進行工業(yè)化生產(chǎn)需要重點研究的方面。

殼聚糖，酶解，低聚水溶性殼聚糖

甲殼素(chitin，2－氨基－2脫氧－D－葡聚糖)是一種廣泛存在于生物界的天然多糖。殼聚糖(chitosan)是指甲殼素脫乙酰度在55%以上的多糖，它是2－氨基－2－脫氧－D－葡糖和2－乙酰氨基－2－葡糖兩種單體通過 β－1，4糖苷鍵連接的多糖混合物［1－2］。殼聚糖及其衍生物可廣泛應用在食品、生物醫(yī)藥和化妝品中［3－4］。這些具有生物活性的殼聚糖多為低聚物，因此由高聚殼聚糖降解制備低聚殼聚糖成為研究熱點。國內(nèi)外降解殼聚糖的方法主要分為化學法、物理法和酶法?；瘜W法主要通過無機強酸和H2O2等氧化性極強的基團，斷裂殼聚糖的β－1，4糖苷鍵得到殼聚糖低聚物，該反應不易控制，環(huán)境污染嚴重［5］;物理法主要包括超聲波降解法、微波降解法和光降解法等，分別通過超聲波引發(fā)的機械力、微波加熱引起的分子震動和摩擦、H2O2吸收光產(chǎn)生自由基等作用斷裂β－1，4糖苷鍵使得殼聚糖降解，該反應過程存在產(chǎn)物收率低和反應不完全等缺點［6］。酶法降解殼聚糖是通過專一性酶和非專一性酶降解高聚殼聚糖制備低聚殼聚糖的方法，其中專一性酶主要指殼聚糖酶，非專一性酶包括脂肪酶、蛋白酶、纖維素酶和溶菌酶等。酶法降解殼聚糖有反應條件溫和且容易控制、安全性高、環(huán)境污染少和能得到特定聚合度產(chǎn)物等優(yōu)點。與化學法和物理法降解殼聚糖相比，酶解所得低聚殼聚糖已經(jīng)成為工業(yè)化制備具有生理活性殼聚糖最有前景的方法。但是酶解殼聚糖反應過程復雜，反應機理目前尚不十分清楚，還需要人們繼續(xù)探索。本文對專一性酶和非專一性酶降解殼聚糖以及殼聚糖酶解產(chǎn)物的應用進行如下概述。

1 專一性酶降解殼聚糖

殼聚糖酶(chitosanase)是專一性降解殼聚糖的酶，Monaghan［7］最先發(fā)現(xiàn)它可以專一性的降解殼聚糖而不降解呈膠態(tài)的甲殼素。該酶多存在于真菌細胞如青霉菌中，少量存在于細菌如芽孢桿菌等生物中。真菌中產(chǎn)殼聚糖酶的菌株較多，如青霉菌和假單胞菌等。方祥年等［8］從誘變得到的球孢白僵菌Beauveria bassiana 1316－V1的培養(yǎng)液中分離純化得到分子量為36ku，比活力為45U/mg的殼聚糖酶。葛正紅等［9］從青霉菌(Penicilium sp.)的發(fā)酵液中分離得到純化182倍的殼聚糖酶，該酶的比活力為1020U/mg。鄭連英等［10］用抗生素和紫外光誘變青霉菌Penicillium sp.ZD－Z1，從它的發(fā)酵液中得到酶活力為1.58U/mL的殼聚糖酶粗酶液。王艷等人［11］從變異的假單胞菌發(fā)酵液中得到酶活力為3.0U/mL的殼聚糖酶粗酶液。專家對細菌產(chǎn)殼聚糖酶的研究較少，王平平等［12］從細菌的發(fā)酵液中得到殼聚糖酶，并對它的性質(zhì)進行了初探。葉淑紅等［13］對實驗室分離的細菌Streptomyces BK2進行發(fā)酵得到的粗酶液的酶活力為1.29U/mL。

自然界中每年可以產(chǎn)生的十億t甲殼素，這些甲殼素可以直接被甲殼素酶(chitinase)降解或者經(jīng)過脫乙酰基再被殼聚糖酶降解。

1.1 殼聚糖酶降解殼聚糖

雖然很多真菌和細菌等微生物都能產(chǎn)生殼聚糖酶，但是不同來源的殼聚糖酶降解殼聚糖的最佳工藝條件各不相同。方祥年等［8］用球孢白僵菌Beauveria bassiana發(fā)酵得到殼聚糖酶，它的最適反應條件是溫度60℃，pH 4.0。該酶在37℃以下、pH2.0～5.0之間穩(wěn)定性好，Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ni2+是它的強抑制劑，Ag+、Mn2+對它也有較強抑制作用，F(xiàn)e2+有輕微激活作用。葛正紅等［9］用青霉菌(Penicilium sp.)發(fā)酵得到殼聚糖酶，該酶降解殼聚糖最適條件為50℃和pH 5.0，金屬離子Mg2+和Ca2+對酶活力有一定的促進作用，重金屬離子Cu2+、Ni2+和Zn2+對酶有較強的抑制作用。李風平［14］等人應用平板透明圈法從19株腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)中篩選出產(chǎn)殼聚糖酶的菌體(0114)，發(fā)現(xiàn)該酶的最適反應溫度為50℃，如果在50℃下加入該酶45mU/mL降解殼聚糖6h，降解率可達26.7%，酶解產(chǎn)物經(jīng)薄層層析分析表明其中低聚殼聚糖含量較高。方文建等［15］利用Penicillium sp.ZD－Z1發(fā)酵生產(chǎn)的殼聚糖酶制備低聚殼聚糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30℃、pH 5.0、加酶量0.01U/mL和底物濃度4%是該酶制備低聚殼聚糖的最佳條件。葉淑紅等［13］用細菌發(fā)酵的粗酶液降解殼聚糖，發(fā)現(xiàn)在溫度30℃和pH 6.0水解殼聚糖48h能得到不同聚合度的低聚殼聚糖。

不同來源的殼聚糖酶水解殼聚糖的最佳條件不同，但是不同殼聚糖酶最適底物的脫乙酰度和酶解產(chǎn)物的聚合度卻大體相同。Fenton等［16］用脫乙酰度70%和 40% 的殼聚糖為底物，經(jīng)過 Penicillium islandicum殼聚糖酶降解得到了聚合度為3的N－乙?；鶜ぞ厶呛途酆隙葹?的低聚殼聚糖，并且產(chǎn)物的末端都是N－乙酰氨基葡糖基團。Takiguchi［17］用芽孢桿菌屬SP.7－M菌株所產(chǎn)生的殼聚糖酶降解殼聚糖，產(chǎn)物為聚合度2～5的低聚殼聚糖，他發(fā)現(xiàn)以不同聚合度殼聚糖為底物經(jīng)過殼聚糖酶降解產(chǎn)物也會不同。Izume等［18］從脫乙酰度70%、76%、84%、90%的殼聚糖中篩選出能夠通過殼聚糖酶降解得到殼五糖、殼六糖或者殼七糖的底物，他們發(fā)現(xiàn)脫乙酰度在90%到84%的殼聚糖是最佳底物。Hutadiolk等［19］發(fā)現(xiàn)在非均相中脫乙酰度不是很高的殼聚糖更容易被酶水解，但是當脫乙酰度比較小時，底物基本不能被水解。陳小娥等［20］用殼聚糖酶ChinB降解殼聚糖得到產(chǎn)物的聚合度以3～5為主。

1.2 殼聚糖酶降解殼聚糖機理

殼聚糖酶主要分為內(nèi)切型和外切型兩種類型，現(xiàn)在被研究的大部分是內(nèi)切型殼聚糖酶。這是因為內(nèi)切酶可以隨機切斷殼聚糖的β－1，4糖苷鍵得到相應的低聚物，十分適合于制備低聚殼聚糖，而外切酶只能從糖鏈的非還原末端逐個切下單糖殘基，得到的產(chǎn)物是單糖［21］。Fukamizo等［22］研究發(fā)現(xiàn)兩種不同來源的殼聚糖酶均可以通過酶解相同的底物生成N－乙酰氨基葡糖在還原端而氨基葡糖在非還原端的雜化低聚糖、氨基葡糖二聚體以及N－乙酰氨基葡糖三聚體。這表明殼聚糖酶可以斷裂N－乙酰氨基葡糖與氨基葡糖之間、兩個氨基葡糖之間的糖苷鍵。并且他還猜想殼聚糖酶催化部位附近有兩個亞單位，其中一個只能結(jié)合氨基葡糖不能結(jié)合N－乙酰氨基葡糖，另一個兩者都可以結(jié)合。吳綿斌等［23］用四階定步長Runge－Kutta方法結(jié)合Powell優(yōu)化方法對里氏木霉ATCC56764產(chǎn)生的殼聚糖酶隨機進攻動力學模型進行了計算，得到了模型參數(shù)的優(yōu)化值。模型計算結(jié)果表明，隨機進攻動力學模型能夠合理地描述和解釋酶法降解的過程。陳小娥等［20］研究表明，殼聚糖酶內(nèi)切作用于兩個氨基葡糖之間、氨基葡糖與N－乙酰氨基葡糖之間的糖苷鍵，然而卻不能斷裂兩個N－乙酰氨基葡糖之間糖苷鍵。

由此可見，殼聚糖酶多以內(nèi)切方式降解殼聚糖，它的最適溫度是30～60℃，最適pH2～5。Cu2+和Ni2+是殼聚糖酶抑制劑，酶的最適底物為脫乙酰度在80%～90%的殼聚糖，產(chǎn)物為聚合度在10以下的低聚殼聚糖。由于殼聚糖酶價格十分昂貴且發(fā)酵得到的殼聚糖酶酶活力比較低，這種酶不適宜大規(guī)模生產(chǎn)和應用，只能停留在實驗室研究階段。

2 非專一性酶降解殼聚糖

因為殼聚糖酶的價格很高且無法進行工業(yè)化生產(chǎn)，所以很多研究者開始研究價格較低且降解殼聚糖能力較強的非專一性酶。Pantaleone等人［24］首次發(fā)現(xiàn)不同來源的非專一性酶對殼聚糖都有降解作用。后來Yalpani［25］發(fā)現(xiàn)非專一性酶中有的酶對殼聚糖的降解活性與殼聚糖酶相似，有的酶甚至超過了殼聚糖酶。目前降解殼聚糖的非專一性酶主要包括溶菌酶、纖維素酶、脂肪酶和蛋白酶等。

2.1 溶菌酶

溶菌酶(lysozyme)存在于雞蛋蛋白、人唾液以及眼淚和體液中，它能水解甲殼素、殼聚糖和細菌細胞壁的粘多糖等。很多研究者對溶菌酶降解殼聚糖的最適條件進行了研究。周孫英等［26］通過實驗發(fā)現(xiàn)，以殼聚糖為底物的溶菌酶酶解反應符合米氏方程，反應的最適宜溫度為50℃，pH 8.0，并且殼聚糖的脫乙酰度越低降解速度越快。馬如等［27］研究了溶菌酶降解殼聚糖的條件，該酶的最適反應條件是溫度45℃，pH 5.0，一定濃度的Cu2+、Zn2+、Ba2+、Cr3+可作為溶菌酶的促進劑，而K+、Ca2+和高濃度的Zn2+則起到抑制劑的作用。張立彥等［28］研究了溶菌酶對殼聚糖的降解條件，結(jié)果表明，脫乙酰度約70%的殼聚糖易被溶菌酶水解，酶解最佳條件是溫度55℃、pH 4.0，在水解反應初期溶液中還原糖濃度迅速增加，水解6h后還原糖的含量可達6.758mmol/L，酶解液中還原糖濃度與殼聚糖的濃度呈線性關(guān)系。

此外，也有很多對溶菌酶最適作用底物和酶解產(chǎn)物的報道。Nishimura等［29］實驗發(fā)現(xiàn)用溶菌酶降解O－羧甲基取代的甲殼素(取代度為80%)，底物粘度下降很快。Ishiguro等［30］發(fā)現(xiàn)溶菌酶可以將聚合度很高的(通常大于1000)部分脫乙?；臍ぞ厶撬獬删酆隙仍?0左右的低聚殼聚糖，并且他們還發(fā)現(xiàn)溶菌酶的一個亞單位(D)對含N－乙?；咸菃挝坏臍ぞ厶呛苊舾?。Kjell M Varum等人發(fā)現(xiàn)［31］溶菌酶對殼聚糖的作用會隨著殼聚糖乙?；潭鹊纳叨?，而完全脫乙?；臍ぞ厶遣荒鼙蝗芫附到?，這個結(jié)果為人體的殼聚糖植入技術(shù)提供了理論依據(jù)。

從前面的研究報道中可以看出，溶菌酶在溫度40℃到60℃、pH4.0～8.0時表現(xiàn)出對殼聚糖良好的降解能力。它的最適底物是脫乙酰度在70%～80%的殼聚糖，而完全脫乙酰的殼聚糖不能被它降解，產(chǎn)物為聚合度10左右的低聚殼聚糖。

溶菌酶在對殼聚糖的降解方面有很好的開發(fā)潛力，它在人體當中就存在且有殺菌消炎的作用。深入研究它的反應原理可讓其在低聚殼聚糖的工業(yè)化生產(chǎn)上發(fā)揮更大的作用。

2.2 纖維素酶

纖維素酶(cellulose)是指對纖維素有催化作用的一種酶。殼聚糖和纖維素分別是殼聚糖酶和纖維素酶的底物，它們在結(jié)構(gòu)上十分相似，都是D－葡糖單元由β－1，4糖苷鍵連接，區(qū)別在于它們糖環(huán)上2位的基團分別為氨基(乙酰氨基)和羥基。由于殼聚糖酶和纖維素酶的底物十分相似，兩種酶的性質(zhì)可能相差不大。

關(guān)于纖維素酶降解殼聚糖的最佳工藝研究有很多，如陳盛等［32］實驗發(fā)現(xiàn)纖維素酶能很容易的降解殼聚糖，在2h內(nèi)使得殼聚糖粘度下降到原來的7%，酶解最適條件是溫度30～40℃、pH 5.0到6.0。纖維素酶解反應得到的米氏常數(shù)Km=9.4×10－2g/L，金屬離子 Na+和 Fe2+對酶活性無影響，而 Zn2+、Mg2+、Cu2+、Li+、K+是酶的抑制劑，底物的脫乙酰度在80%～90%時酶解反應速度較快。周桂等［33］研究了纖維素酶降解殼聚糖的工藝條件，發(fā)現(xiàn)反應的最適溫度50℃、pH 5.4。劉靖等［34］研究發(fā)現(xiàn)纖維素酶可以有效降解殼聚糖，它的最適溫度為60℃，最適pH5.2，酶解反應米氏常數(shù)為 Km=10mg/mL，酶的激活劑是Mn2+、Mg2+和Ca2+，抑制劑是Ag+、Cu2+和Hg2+，最適作用的底物為脫乙酰度為90%的殼聚糖。劉羿君等［35］研究了特種纖維素酶催化水解殼聚糖，發(fā)現(xiàn)其最佳水解條件是溫度58℃，pH5.3，反應時間3h，底物濃度為1%。孫婷等［36］用纖維素酶酶液和粗酶粉對殼聚糖進行降解，發(fā)現(xiàn)該酶降解殼聚糖的最適條件為溫度50℃、pH 5.0、加酶量8U/g、底物濃度3%。

另外，人們對纖維素酶降解殼聚糖的最適底物和酶解產(chǎn)物也進行了研究。Muraki等［37］用纖維素酶降解殼聚糖得到聚合度在10以內(nèi)的低聚殼聚糖占酶解產(chǎn)物70%以上，其中具有生理活性的占一半左右。劉靖等［30］研究表明，在纖維素酶降解殼聚糖的反應開始的15min內(nèi)，底物粘度迅速下降一半，該酶的最適作用底物為脫乙酰度90%的殼聚糖，并且它能水解氨基葡糖之間和乙酰氨基與氨基葡糖之間的糖苷鍵。孫婷等［36］用纖維素酶降解脫乙酰度96%的殼聚糖，發(fā)現(xiàn)酶解反應在特定條件下進行20h后能得到聚合度為4的低聚殼聚糖，這證明了纖維素酶以內(nèi)切方式降解殼聚糖。

由此可見，纖維素酶降解殼聚糖最適條件是溫度30～60℃、pH5.5，Cu2+和Hg2+是酶的抑制劑，酶解最適底物是脫乙酰度85%的殼聚糖。除了纖維素酶降解殼聚糖最適pH偏高和酶解產(chǎn)物分子量分布范圍比較廣［38］之外，纖維素酶和殼聚糖酶降解殼聚糖的其他條件也很相似，且它們一般都以內(nèi)切方式斷裂β－1，4糖苷鍵，降低殼聚糖聚合度。纖維素酶降解殼聚糖，成本低廉，酶解反應容易操作，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

2.3 脂肪酶

脂肪酶(Lipase)是一種催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯的酶。然而，脂肪酶對殼聚糖的降解表現(xiàn)出十分強的活性，這使得專家們對脂肪酶降解殼聚糖的最佳條件、最適底物和酶解產(chǎn)物等方面進行了研究。

周孫英［39］等用豬胰腺脂肪酶降解殼聚糖分子鏈中β－1，4糖苷鍵。結(jié)果表明，豬胰來源的脂肪酶在溫度40℃到50℃、pH在3左右，降解殼聚糖2h后，底物粘度下降了93%。馬如等［40］用豬胰脂肪酶降解殼聚糖發(fā)現(xiàn)其最適條件為溫度55℃、pH=5.0、反應時間2h。王麗娟等［41］研究了脂肪酶降解殼聚糖的反應條件，發(fā)現(xiàn)其最適水解條件為溫度50～55℃、pH為5～5.5、反應時間3～4h，酶解反應不符合米氏方程，酶的激活劑是3mmol/L的Cu2+、10mmol/L的Mg2+和Ca2+、10mmol/L的Ba2+，Zn2+和Fe3+對該酶有一定的抑制作用。張洪威等［42］對脂肪酶降解殼聚糖最佳工藝進行研究，發(fā)現(xiàn)其水解殼聚糖最佳條件是在溫度55℃、加酶量700U/g，降解殼聚糖2h。

Muzzarelli［43］等人對麥胚脂肪酶降解殼聚糖進行了研究，發(fā)現(xiàn)麥胚脂肪酶能夠有效降解殼聚糖，但是得到產(chǎn)物的聚合度較廣，反應結(jié)束后底物的粘度下降了65%，并且發(fā)現(xiàn)N－羧甲基化的殼聚糖表現(xiàn)出對酶更高的活性。Shin［44］等人研究發(fā)現(xiàn)日本根霉產(chǎn)的脂肪酶能對水溶性殼聚糖進行降解，水解產(chǎn)物分子量在30～50ku之間且能溶于pH呈中性的水中。周孫英［39］等用豬胰腺脂肪酶降解殼聚糖發(fā)現(xiàn)脫乙酰度在70%到90%之間的底物降解速度最快。李冬霞［45］從四種商品脂肪酶中篩選出具有較強水解殼聚糖能力的酶Aspergillus Oryzae，并且對這種酶做了詳細的研究，發(fā)現(xiàn)脂肪酶的最適作用底物為脫乙酰度73%和82%的殼聚糖，生成的產(chǎn)物是聚合度2到6的低聚物，純化后的脂肪酶對脫乙酰度為73%、81%和82%的殼聚糖都有很強的活性。

由此可見，不同來源的脂肪酶降解殼聚糖的最佳條件相似即溫度在50℃左右、pH3～6，它的最適底物是脫乙酰度80%的殼聚糖。脂肪酶現(xiàn)在已經(jīng)能夠進行工業(yè)化生產(chǎn)，成本比較低，且對殼聚糖活性較高。因此，從商品脂肪酶中選擇具有較高水解殼聚糖活性的酶來大量生產(chǎn)低聚殼聚糖的前景十分廣闊。

2.4 蛋白酶

蛋白酶是指能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)水解成氨基酸或多肽的酶。近年來，人們發(fā)現(xiàn)蛋白酶對殼聚糖具有較高的降解能力，它成為研究酶法降解殼聚糖的一個新熱點。

陳云等人［46］研究了中性蛋白酶降解殼聚糖的工藝條件，發(fā)現(xiàn)以殼聚糖為底物的酶最適溫度為50℃、pH 6.0，米氏常數(shù) Km=1.1×10－2g/mL，抑制劑是Cu2+，Ba2+，Mn2+離子。黃永春等［47］人實驗發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶降解殼聚糖的最佳條件是溫度45℃和pH 4.5，降解過程符合米氏方程。李和生等［48］對木瓜蛋白酶的水解工藝進行了研究，發(fā)現(xiàn)它降解殼聚糖的最佳工藝條件是溫度45℃、pH 4.0、底物濃度1%、底物與酶的比例為25∶1(w/w)并且酶對脫乙酰度70%的底物有比較高的活性。該酶在最適條件下水解殼聚糖約60min，得到的產(chǎn)物平均分子量在一萬以內(nèi)，殼聚糖的起始降解速率很快，20min后粘度變化趨于平穩(wěn)，60min后基本維持在93%～94%。

研究者們除了對蛋白酶降解殼聚糖的酶解工藝進行研究，還對蛋白酶的作用方式進行了探討。Terboj－evich［49］等實驗發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶能很快降解殼聚糖且主要是斷裂殼聚糖內(nèi)部的氨基葡糖與N－乙酰氨基葡糖之間的糖苷鍵。陳云［50］等人研究了胃蛋白酶水解殼聚糖的最適條件，發(fā)現(xiàn)隨著殼聚糖脫乙?；鹊奶岣呶傅鞍酌富钚越档停麄冋J為胃蛋白酶降解殼聚糖時要求β－1，4糖苷鍵的一端是N－乙酰氨基葡糖殘基。蘇暢［51］等人研究發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶能斷裂氨基葡糖與N－乙酰氨基葡糖之間和兩個氨基葡糖之間的糖苷鍵。

總之，蛋白酶降解殼聚糖最佳條件是溫度40℃到50℃、pH為4.0～6.0，它的最適底物是脫乙酰度70%的殼聚糖且酶解過程符合米氏方程。蛋白酶對殼聚糖的活性較高、它的價格低廉且已經(jīng)成為商品酶，因此用蛋白酶降解殼聚糖是近些年來發(fā)現(xiàn)的一個制備低聚殼聚糖的新方法。然而，我們還需要進一步弄清楚蛋白酶水解殼聚糖的反應過程和機理等基礎性問題以實現(xiàn)蛋白酶工業(yè)化生產(chǎn)低聚殼聚糖的目的。

2.5 非專一性酶降解殼聚糖機理

非專一性酶降解殼聚糖的機理，現(xiàn)在國內(nèi)外專家還沒有定論。有一種解釋是這些非專一性酶如蛋白酶和脂肪酶中含有一些專一性很強的殼聚糖酶，但是Pantaleone［24］認為這種理論無法解釋為何非專一性酶降解殼聚糖的活性強于專一性酶，并且實驗中占非專一性酶數(shù)量四分之一的酶不具有或具有較低降解殼聚糖的能力。此外，從酶的催化作用以及它的來源看出每種酶又并不存在共同的活性中心，有的學者認為殼聚糖分子鏈上的羥基是非專一性酶降解殼聚糖的關(guān)鍵所在。文獻中［52－54］有一種方法可以將低聚殼聚糖合成高聚殼聚糖即糖基轉(zhuǎn)移法，Nocardia orientalis IFO1280菌株合成的甲殼素酶在一定條件下能將N－乙酰氨基葡糖四聚和五聚體催化生成七聚體，這可能是因為糖鏈中的羥基與氨基在溶液中通過某種方式對非專一性酶的催化基團起作用，如果這個反應可以逆向進行，那么這對于研究殼聚糖降解機理有很大幫助。

非專一性酶對殼聚糖的降解過程復雜，其降解原理并不清楚。但是與非專一性酶相比，殼聚糖酶價格十分昂貴，它對殼聚糖的活性要比一些非專一性酶低一些［25］。因此，加強對非專一性酶降解殼聚糖反應原理的研究和發(fā)明一種應用該種酶工業(yè)化生產(chǎn)功能性低聚殼聚糖的技術(shù)將成為國內(nèi)外的研究趨勢。

3 酶法降解殼聚糖產(chǎn)物的應用

酶法降解殼聚糖生成的產(chǎn)物是低聚殼聚糖，它在食品、生物醫(yī)藥和化妝品等方面有著廣泛的應用。

3.1 低聚殼聚糖在食品上的應用

低聚殼聚糖是天然陽離子型大分子物質(zhì)，它具有抑菌、絮凝沉降、降低血糖和瘦身保健等多種對人體有益的功能，被廣泛用于食品中［55］。

3.1.1 抑菌劑 低聚殼聚糖具有一定的殺菌和抑菌作用。吳小勇等［56］發(fā)現(xiàn)不同脫乙酰度和不同分子質(zhì)量的低聚殼聚糖都有抑菌作用，在pH為5.5～6.0的條件下殼聚糖具有最強的抑菌活性，在實驗條件下低聚殼聚糖的抑菌活性高于苯甲酸鈉。于艷敏等［57］研究發(fā)現(xiàn)，酶解制備的低聚殼聚糖對抗藥性的大腸桿菌有很好的抑制效果，最低抑菌濃度為0.05%，酶解產(chǎn)物濃度2.5%時抑菌圈直徑可達18.6mm。這可能是因為低聚殼聚糖在細胞表面形成一層阻止營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞的膜，或者它進入細胞和細胞質(zhì)內(nèi)的離子形成絡合物干擾細胞代謝從而起到抑菌作用［58］。研究表明［59］，在醬油中添加一定量的低聚殼聚糖可以抑制腐敗菌的生長，抑制效果強于苯甲酸鈉并對醬油的色澤和香味影響很小。因此，將低聚殼聚糖制成抑菌劑加入到食品中可以起到延長食品保質(zhì)期的作用。

3.1.2 果蔬保鮮劑 影響果蔬保存的因素主要有致病微生物侵染、果蔬的水分蒸發(fā)以及呼吸作用，低聚殼聚糖不僅具有良好的抑菌能力而且也有保濕、增濕和抑制果蔬呼吸的作用。邵健等［60］研究表明，低聚殼聚糖具有良好的吸濕和保濕功能即使在相對濕度為42%的環(huán)境中仍然不釋放其中的水，只有在硅膠干燥器這種相對濕度很小的環(huán)境中低聚殼聚糖才放出吸收的水，這可能是因為它涂在水果表面時會形成一層薄膜，它的極性基團會與空氣中的水分子形成氫鍵以保持水果表面濕潤。水茂興等［61］通過實驗發(fā)現(xiàn)不同分子量的低聚殼聚糖混合配成的保鮮液能夠?qū)⑶嘟泛头言诔叵沦A藏時間長達15d，這可能是因為低聚殼聚糖在果蔬表面會形成低O2高CO2的環(huán)境，抑制其呼吸作用，使果蔬保持新鮮。

3.1.3 澄清除雜劑 低聚殼聚糖是帶有陽離子的大分子物質(zhì)，它對蛋白質(zhì)、核酸和果膠等有非常好的絮凝和沉降作用，可以用于果汁、酒和醋等液體的澄清以除去雜質(zhì)。何志剛等［62］通過實驗發(fā)現(xiàn)，用低聚殼聚糖澄清楊梅果酒具有速度快、酒體穩(wěn)定和對果酒內(nèi)的營養(yǎng)成分影響小的優(yōu)點，澄清度能達到91.4%。梁茂雨等［63］用低聚殼聚糖澄清西番蓮果汁，果汁的透光率達91.13%且營養(yǎng)的損失率較低。于淑蘭［64］應用低聚殼聚糖澄清姜汁，姜汁的透光率達98%。由此可見，低聚殼聚糖是很好的澄清除雜劑。

3.1.4 降血糖劑 近年來，很多研究者發(fā)現(xiàn)低聚殼聚糖有良好的降血糖功效，并且它是天然化合物，對人體無毒副作用。尤行宏等［65］用低聚殼聚糖對糖尿病大鼠進行實驗，發(fā)現(xiàn)低聚殼聚糖可以明顯降低其血糖濃度，使血液中胰島素含量升高(P＜0.01)并能維持體重(P＜0.01)，但是低聚殼聚糖對正常大鼠的血糖和血液中胰島素含量沒有影響。孫萍等［66］研究發(fā)現(xiàn)水溶性低聚殼聚糖能夠明顯降低糖尿病小鼠的血糖含量(P＜0.05)，使其肝糖原含量增加明顯(P＜0.01)，而對正常小鼠的血糖無影響。韓永萍等［67］經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，由酶法制備的低聚殼聚糖有很高的降血糖活性(P＜0.01)，甚至優(yōu)于降糖作用很好的拜糖蘋，并同時起到保肝護腎的功效。低聚殼聚糖降血糖的原因可能是在生物體血糖含量異常時，它刺激胰島細胞增加胰島素分泌、促進肝糖原合成和調(diào)節(jié)葡萄糖在動物小腸內(nèi)的吸收從而起到降血糖的作用［65－66］。因此，添加了低聚殼聚糖的食品對血糖偏高的人群有很好的保健作用。

3.1.5 降脂瘦身劑 隨著人們生活水平的提高，降脂瘦身成為人們的需求之一，低聚殼聚糖近年來展現(xiàn)出良好的降脂活性，受到專家們的關(guān)注。翁娜等［68］研究發(fā)現(xiàn)，水溶性低聚殼聚糖能明顯降低高血脂小白鼠血液中總膽固醇、甘油三酯水平和丙二醛含量，降幅分別達到28%、30%和40%。李玲等人［69］發(fā)現(xiàn)低聚殼聚糖和殼聚糖能夠明顯降低高血脂大鼠的血清總膽固醇和甘油三酯(P＜0.01)，并使得血清高密度脂蛋白膽固醇升高(P＜0.05)。覃容貴等［70］用低聚殼聚糖喂養(yǎng)高血脂大鼠8周，發(fā)現(xiàn)低聚殼聚糖能顯著降低血清總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的含量(P＜0.01)，明顯升高血清高密度脂蛋白膽固醇的含量(P＜0.01)和降低大鼠的體重(P＜0.01)。低聚殼聚糖降脂機理目前還沒有定論，可能是由于它在胃中能形成凝膠吸附脂肪和膽固醇，降低血清總膽固醇和甘油三酯的含量，并且分子量較低的低聚殼聚糖可以進入細胞中發(fā)揮降血脂功能［68－70］。因此，將低聚殼聚糖添加到食品中將對血脂偏高人群有良好的降脂保健的作用。

3.2 低聚殼聚糖在生物醫(yī)藥上的應用

低聚殼聚糖是天然大分子物質(zhì)并有著較強的水溶性、生物活性和生物相容性，這使得它在生物醫(yī)藥上的用途廣泛。呂中明等［71］對低聚殼聚糖免疫調(diào)節(jié)作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)低聚殼聚糖能增強小鼠血清溶血素反應和巨噬細胞功能(P＜0.01)。杜昱光等［72］研究發(fā)現(xiàn)，低聚殼聚糖對癌細胞有較強的抑制作用，對S180癌細胞DNA抑制率可達98.5%;對肝癌細胞的抑制率可達76%，他們還發(fā)現(xiàn)低聚殼聚糖在胃內(nèi)可以保護和修復損傷部位，抵抗胃酸抑制胃潰瘍的形成［73］。此外，低聚殼聚糖多用于與人體直接接觸的人造皮膚、手術(shù)縫合線、人工透析膜、醫(yī)用紗布等多種醫(yī)用材料中，還可以制成蛋白質(zhì)或多肽類藥物載體，保護藥物不被人體內(nèi)的蛋白酶降解，提高藥物的利用率［74－75］。

3.3 低聚殼聚糖在化妝品中的應用

低聚殼聚糖應用到化妝品中主要是由于它良好的保濕增濕的特性［60］。研究者將低聚殼聚糖復配到護膚化妝品中既可以防止化妝品中水分流失又可以鎖住皮膚表面水分并且能保持皮膚彈性，不會阻礙廢物和毒素從皮膚表面排出，日本開發(fā)出添加有低聚殼聚糖的油包水化妝品，他們在37℃用酶降解殼聚糖8h得到的低聚殼聚糖復配到化妝品中，添加量約為5%，發(fā)現(xiàn)這種化妝品較以前具有更好的柔軟性和保濕性［76］。另外，低聚殼聚糖添加到化妝品中除了能保濕增濕，還能有效地抑制微生物的滋生［56－57］和清除人體內(nèi)活潑氧自由基，起到抗衰老的作用。尹學瓊等［77］研究發(fā)現(xiàn)，低聚殼聚糖對超氧自由基有較強的清除能力，濃度為0.5×10－2g/mL時，清除率可達98.2%，且其對豬油的抗氧化能力和VE、叔丁基對苯二酚相近。陳燕青等［78］研究發(fā)現(xiàn)，由殼聚糖制備的水溶性低聚殼聚糖對超氧自由基清除率可達75.61%。姚倩等［79］對低聚殼聚糖抗氧化性進行了研究，發(fā)現(xiàn)低聚殼聚糖對羥自由基和DPPH自由基有較強的清除和還原能力，在濃度為10mg/mL時低聚殼聚糖對羥自由基清除率可達85.5%，而未降解的殼聚糖衍生物在相同濃度下的清除率為6.9%。孫濤等［80］對低聚殼聚糖衍生物的抗氧化性作了研究，發(fā)現(xiàn)它對超氧陰離子的半抑制濃度為8.40mg/mL，對羥自由基的半抑制濃度為0.440mg/mL。研究表明［78］，低聚殼聚糖的活性氨基和羥基決定了它的抗氧化能力大小，聚合度越低的殼聚糖越能暴露出更多的活性氨基和羥基，因而具有更好的抗氧化活性。

總之，殼聚糖的酶解產(chǎn)物被廣泛的應用到食品、醫(yī)藥和化妝品中，已經(jīng)和人們的生活密切相關(guān)。隨著人們對酶法降解殼聚糖研究的不斷深入，人們會發(fā)現(xiàn)更多種類的具有生理活性的低聚殼聚糖并且會不斷增強其生理活性，使得低聚殼聚糖應用的范圍變得更廣。

4 結(jié)論

近些年來，人們發(fā)現(xiàn)酶法降解殼聚糖產(chǎn)生的低聚殼聚糖產(chǎn)物具有多種生理活性，這使得低聚殼聚糖在如化妝品、食品和生物醫(yī)藥等領域得到了廣泛的應用［2－4］，并且殼聚糖的酶法降解及其產(chǎn)物的應用已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的熱點之一。國內(nèi)外專家對專一性酶和非專一性酶降解殼聚糖最適條件以及產(chǎn)物的研究都比較深入，但是對酶解反應原理尤其是非專一性酶的作用原理的研究很少，很多的酶解反應機制并不清楚。這就使得酶解法制備殼聚糖大都處在實驗室階段而并沒有應用于工業(yè)化生產(chǎn)。因此我們還需要對以下幾個方面進行更加深入的研究來實現(xiàn)酶法制備殼聚糖的工業(yè)化。

首先，應用物理化學手段對底物或酶進行處理以了解殼聚糖的酶解機理。我們可以應用物理法將殼聚糖分子做某種形式的處理，再通過酶解來得到低聚殼聚糖，分析產(chǎn)物的聚合度來分析酶的作用方式;也可以通過化學手段修飾酶分子或底物分子來促進或抑制產(chǎn)物得率，間接反映酶解的作用機理。用物理法預處理底物時可能會使低聚殼聚糖的產(chǎn)量增加，提高其經(jīng)濟效益。其次，我們可以用一種已知酶解機理的酶A與未知機理的酶B共同降解底物，通過復合酶與單一酶A在相同條件下降解殼聚糖產(chǎn)物的不同來推測酶B的酶解機理。另外，通過外加裝置可以實現(xiàn)生物酶降解殼聚糖反應和產(chǎn)物分離同時進行，這有利于實時分析酶解產(chǎn)物的聚合度。但要注意酶解反應的過程中需要不斷將產(chǎn)物分離出去以使得反應正向進行。

目前，酶解殼聚糖反應原理是國內(nèi)外研究的熱點。隨著科技的進步，酶促反應的相關(guān)理論將會更加成熟，各種新的酶解殼聚糖工藝將會出現(xiàn)。具有多種生理活性的低聚殼聚糖將會在食品、生物醫(yī)藥和化妝品中發(fā)揮更大的作用。

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The review of enzymatic hydrolysis of chitosan and its product application

DOU Shen，LIAO Yong－h(huán)ong*，YANG Chun－xia，REN Wen－ya，XU Jin
(School of Food/Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China)

Chitosan is a natural biological polysaccharide and it is originated from Chitin.After several steps of degradation，it shows excellent biological activity.Specific and non－specific enzymatic hydrolysis of chitosan and its product application were introduced，and several aspects about water－solubleoligo－chitosan manufacturing were showed.

chitosan;enzymatic of hydrolysis;water－solubleoligo－chitosan

TS201.2

A

1002－0306(2011)12－0537－07

2010－11－16 *通訊聯(lián)系人

竇屾(1986－)，男，在讀研究生，主要從事有關(guān)食品生物技術(shù)方面的研究。

國家“十二五”科技支撐計劃項目(2011BAC11B00)。