無(wú)抗性選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因技術(shù)在蔬菜作物上的應(yīng)用

王 燁 顧興芳

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

隨著人們生活水平的提高，蔬菜、花卉類園藝作物在日常消費(fèi)中的比重越來(lái)越大，人們對(duì)于園藝產(chǎn)品的要求也越來(lái)越高，但在短期內(nèi)傳統(tǒng)的育種手段很難有新的突破，研究人員期望通過(guò)更先進(jìn)的技術(shù)如轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)育種材料進(jìn)行創(chuàng)新和改良。但目前絕大多數(shù)蔬菜作物的轉(zhuǎn)基因研究尚停留在實(shí)驗(yàn)室水平，還未真正走向市場(chǎng)。這不僅與轉(zhuǎn)化效率較低有關(guān)，更與轉(zhuǎn)基因作物的安全性相關(guān)。

1 采用無(wú)抗性選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因技術(shù)的意義

從 1983年獲得第一株轉(zhuǎn)基因煙草以來(lái)，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)有了很大發(fā)展，所涉及的作物種類也越來(lái)越多。截止到2009年，有23個(gè)國(guó)家已經(jīng)批準(zhǔn)基因改造作物的商業(yè)化種植，并且有29個(gè)國(guó)家允許基因改造作物進(jìn)口或?qū)⑵溽尫诺阶匀画h(huán)境中去（Koreen et al.，2009）。隨著轉(zhuǎn)基因作物新品種的問(wèn)世及其商品化的不斷擴(kuò)大，人們對(duì)于轉(zhuǎn)基因技術(shù)在食品安全和生態(tài)環(huán)境安全的關(guān)注也日漸增多，并影響到其應(yīng)用和商業(yè)化進(jìn)程。目前所采用的轉(zhuǎn)基因技術(shù)一般采用抗性選擇標(biāo)記（如抗生素類或除草劑類抗性基因等）對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行篩選。篩選結(jié)束后選擇基因同目的基因一并整合到植物基因組中，其繼續(xù)表達(dá)的產(chǎn)物可能會(huì)對(duì)作物生長(zhǎng)、生態(tài)環(huán)境甚至人類帶來(lái)一系列不安全因素。主要表現(xiàn)在對(duì)食品、藥品的安全影響。當(dāng)抗性選擇標(biāo)記基因是編碼一些動(dòng)物腸道抗生素類的抗性物時(shí)，這些基因可能被轉(zhuǎn)移到微生物中去，這樣就增強(qiáng)了病原微生物的抗藥性，引發(fā)藥物的減效或失效。另一方面轉(zhuǎn)基因作物可能會(huì)影響到生態(tài)環(huán)境安全，如對(duì)抗除草劑基因的使用。如果發(fā)生以花粉為媒介的基因漂流，可能使某些雜草獲得對(duì)除草劑的抗性而成為無(wú)法殺死的“超級(jí)雜草”（Pavletich & Pabo，1991），然而目前還沒(méi)有關(guān)于標(biāo)記基因漂移帶來(lái)危害的報(bào)道（Puchta，2003）。為了規(guī)避具有潛在危險(xiǎn)的抗性標(biāo)記基因可能引發(fā)的安全問(wèn)題，研究者力圖避免使用抗性基因，最早是在馬鈴薯的轉(zhuǎn)化中采用致病性強(qiáng)的農(nóng)桿菌進(jìn)行侵染，不采用標(biāo)記基因而是對(duì)再生植株進(jìn)行篩選，PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化率僅1 %～5 %。該方法的缺點(diǎn)是工作量大且陽(yáng)性率低（de Vetten et al.，2003；Ahmand et al.，2008），優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)化植株無(wú)需進(jìn)行抗性標(biāo)記基因的剔除（Goldbrough et al.，1993；張余洋 等，2004）。現(xiàn)在更多研究者致力于采用安全選擇標(biāo)記基因或者標(biāo)記基因刪除法來(lái)改進(jìn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)。總之，培育無(wú)抗性選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物是當(dāng)前植物基因工程研究迫切需要解決的課題。

2 無(wú)抗性選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因技術(shù)

2.1 安全選擇標(biāo)記基因的應(yīng)用

在轉(zhuǎn)基因過(guò)程中利用安全選擇標(biāo)記基因，利用這些基因編碼的蛋白使轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以繼續(xù)生長(zhǎng)，從而在代謝和生長(zhǎng)過(guò)程中處于優(yōu)勢(shì)，非轉(zhuǎn)化細(xì)胞則會(huì)衰亡；或者是借助某個(gè)基因編碼蛋白的表達(dá)來(lái)改變植株原有的狀態(tài)，使轉(zhuǎn)化植株較容易被識(shí)別出來(lái)。

2.1.1 與糖代謝相關(guān)的基因 磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因（phospho mannoseisomerase gene，pmi）編碼的甘露糖磷酸異構(gòu)酶可以催化 6-磷酸甘露糖轉(zhuǎn)化為 6-磷酸果糖。培養(yǎng)基中的甘露糖被植物吸收后，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的己糖激酶催化為 6-磷酸甘露糖，轉(zhuǎn)化有 pmi的細(xì)胞可以將 6-磷酸甘露糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖，繼而為植物利用，在轉(zhuǎn)化過(guò)程中累計(jì)的ATP也可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供能量（Weisser et al.，1996）。pmi是個(gè)源于植物自身的基因，且甘露糖更是作為甜味劑在食品加工業(yè)中廣為應(yīng)用，是目前發(fā)展較完善的一個(gè)安全標(biāo)記。Joersbo等（1998）早在甜菜上嘗試以甘露糖為選擇壓，效率比以Kam為選擇標(biāo)記高1倍。

在紅色鏈霉菌（Haldrup et al.，1998a）和高溫厭氧芽孢桿菌（Haldrup et al.，1998b）中都有一個(gè)木糖異構(gòu)酶基因（xylose isomerase gene，xylA），編碼木糖異構(gòu)酶，催化D-木糖和D-木酮糖之間發(fā)生互變異構(gòu)。很多植物無(wú)法利用D-木糖，因此在含有D-木糖的選擇培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)化xylA的細(xì)胞可以將D-木糖轉(zhuǎn)化為可利用的D-木酮糖，而那些非轉(zhuǎn)化細(xì)胞則會(huì)因?yàn)槿狈μ荚炊L(zhǎng)受到抑制。該選擇基因較早被應(yīng)用到馬鈴薯上，用xylA作為選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化頻率是用Kam選擇的10倍（Haldrup et al.，1998a），且木糖是人類食品加工業(yè)中常用的添加劑，因此用木糖作為轉(zhuǎn)化選擇標(biāo)記是安全的（Jaiwal et al.，2002）。

一般的植物細(xì)胞不能利用核糖醇為碳源，但大腸桿菌 C菌株可以在兩個(gè)緊密串聯(lián)的操縱子atl/rtl的協(xié)助下在以核糖醇為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，因?yàn)樗鼈兙幋a的蛋白酶分解代謝核糖醇，以其為選擇標(biāo)記在培養(yǎng)基中添加核糖醇就可以篩選出轉(zhuǎn)化植株（Lafayette et al.，2001）。Reiner等（1975）把a(bǔ)tl/rtl從C菌株分別轉(zhuǎn)化到K-12菌株和B菌株中后，兩個(gè)菌株都可以在以核糖醇為碳源的培養(yǎng)基上繼續(xù)正常生長(zhǎng)（Reiner et al.，1975）。但目前未見(jiàn)在植物上成功利用的報(bào)道。此外，2-脫氧葡萄糖-6-磷酸鹽磷酸酯酶基因（DOGR1）（Kunze et al.，2001）和阿拉伯脫氫酶基因（atlD）（Lafayette et al.，2005）也屬于糖類相關(guān)選擇基因，但對(duì)其應(yīng)用不多。

2.1.2 與激素相關(guān)的基因 植物基因組內(nèi)有很多調(diào)節(jié)激素代謝的相關(guān)基因，這些來(lái)源于植物自身的基因同樣可以作為轉(zhuǎn)基因的選擇標(biāo)記基因，而且非常安全。GUS基因來(lái)源于大腸桿菌，編碼β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUS）。GUS常作為報(bào)告基因，但Joersbo和Okkels（1996）利用GUS為選擇標(biāo)記基因?qū)χ参锛?xì)胞進(jìn)行篩選，效率是用Kam選擇的2.9倍。Okkels等（1997）發(fā)現(xiàn)其原理是轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的GUS基因可以作用于選擇培養(yǎng)基中添加的葡萄糖苷酸，從而釋放出有活性的細(xì)胞分裂素來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)，而未轉(zhuǎn)化細(xì)胞則會(huì)分化受阻。

ipt主要源于農(nóng)桿菌 T-DNA，其編碼的異戊稀基轉(zhuǎn)移酶可以催化細(xì)胞分裂素合成的第一步，而細(xì)胞分裂素可以促進(jìn)芽點(diǎn)分化。利用這個(gè)標(biāo)記獲得的轉(zhuǎn)化植株由于激素代謝相關(guān)酶的超量表達(dá)使細(xì)胞分裂素的水平提高，植株的生長(zhǎng)點(diǎn)失去頂端優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)出葉片卷曲、節(jié)間縮短，以此來(lái)鑒別轉(zhuǎn)化植株，但最后必須再利用轉(zhuǎn)座子元件（Ebinuma et al.，1997）或重組酶（Sugita et al.，1999）來(lái)刪除ipt。這一方法已經(jīng)在煙草（Ebinuma et al.，1997；Kunkel et al.，1999；Sugita et al.，2000）上獲得驗(yàn)證。此外，源于根癌農(nóng)桿菌NIAES1724的rolA、rolB和rolC也可通過(guò)提高生長(zhǎng)素活性來(lái)誘導(dǎo)“發(fā)狀根”，以此作為選擇標(biāo)記（薛健 等，2008）。

吲哚-3-乙酰胺水解酶基因IaaH可以編碼調(diào)節(jié)植物吲哚乙酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞在激素代謝上造成差異（Ebinuma & Komanine，2001），從而達(dá)到選擇的目的，但對(duì)其在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用卻較少報(bào)道。

2.1.3 與氨基酸代謝相關(guān)的基因 高等植物中賴氨酸是通過(guò)天冬氨酸途徑合成的，同時(shí)伴隨異亮氨酸、甲硫氨酸和蘇氨酸的合成。此合成途徑的關(guān)鍵酶是天冬氨酸激酶（AK）和二氫吡啶羧酸合成酶（DHDPS），AK受賴氨酸和蘇氨酸的抑制，而DHDPS則嚴(yán)格受賴氨酸的反饋調(diào)控（Mills et al.，1980）。但在細(xì)菌的賴氨酸合成途徑中，AK和 DHDPS對(duì)賴氨酸的反饋調(diào)節(jié)不敏感。因此在賴氨酸和蘇氨酸的選擇培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化了ak的再生植株可以保持較高水平的AK活性，保證了生長(zhǎng)需要的氨基酸，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞則因?yàn)榘被岷铣赏緩绞茏瓒劳觯↗aiwal et al.，2002）。Perl等（1993）克隆了大腸桿菌中對(duì)賴氨酸反饋抑制不敏感的lysC，將其轉(zhuǎn)化馬鈴薯。Brinch-Pedersen等（1999）也用賴氨酸和蘇氨酸為選擇壓，研究轉(zhuǎn)化大麥，但出現(xiàn)較多白化苗。與氨基酸代謝相關(guān)的基因作為標(biāo)記的還有鄰氨基苯甲酸合成酶基因ASAL（Makiko et al.，2005）和乙酰乳酸合成酶基因mALS（Tougou et al.，2009），但都沒(méi)有應(yīng)用到蔬菜作物上。

2.1.4 其他安全選擇標(biāo)記基因 從維多利亞水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并分離出的綠色熒光蛋白基因（GFP）不僅可以在原核生物細(xì)胞中表達(dá)，還可以在真核生物細(xì)胞中表達(dá)，而且不會(huì)影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和功能，其優(yōu)勢(shì)還在于不需要添加任何輔助因子而只需對(duì)其外觀進(jìn)行熒光檢測(cè)就可以加以辨別（Stuber et al.，1998）。GFP在植物遺傳轉(zhuǎn)化中常作為報(bào)告基因，但目前越來(lái)越多的研究將其作為選擇標(biāo)記基因，并已經(jīng)應(yīng)用在煙草（朱生偉 等，2003）、水稻（Chung et al.，2000）、甜菜（Zhang et al.，2001）和甘薯（Lawton et al.，2000）等作物的遺傳轉(zhuǎn)化上。

甜菜堿脫氫酶基因BADH也常作為一個(gè)安全選擇標(biāo)記應(yīng)用到植物遺傳轉(zhuǎn)化中。BADH源于藜科高等植物，其編碼的蛋白可以催化有毒的甜菜堿醛轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的甜菜堿，即在選擇培養(yǎng)基中添加甜菜堿醛作為選擇壓就能篩選出轉(zhuǎn)化植株。Danielle等（2001）以BADH作為選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化煙草葉綠體基因組，轉(zhuǎn)化效率是用壯觀霉素選擇的25倍。

甜椒類鐵氧還蛋白基因PFLP曾用于蘭花的遺傳轉(zhuǎn)化。You等（2003）將PFLP的cDNA構(gòu)建在CaMV35S啟動(dòng)子下，對(duì)蘭花進(jìn)行基因槍和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，以對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌的抗性為標(biāo)記，最終獲得了轉(zhuǎn)基因蘭花植株。

谷氨酸-1-半醛-轉(zhuǎn)氨酶基因hemL編碼谷氨酸-1-半醛轉(zhuǎn)氨酶，其活性會(huì)影響葉綠素的合成。在選擇培養(yǎng)基中添加3-氨基-2，3-二氫苯甲酸就能抑制谷氨酸-1-半醛轉(zhuǎn)氨酶的活性，就無(wú)法正常形成葉綠素（Allison et al.，1997）。從Synechococcus PCC6301中分離得到抗3-氨基-2，3-二氫苯甲酸突變體GR6，其編碼基因hemL 在第5、6、7位發(fā)生絲氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸的刪除，248位蛋氨酸取代異亮氨酸。將此基因轉(zhuǎn)化植物可以提高細(xì)胞對(duì)3-氨基-2，3-二氫苯甲酸的抗性。整合有hemL的轉(zhuǎn)化植株可以在含3-氨基-2，3-二氫苯甲酸的培養(yǎng)基上保持綠色，非轉(zhuǎn)化植株則會(huì)白化（Gough et al.，2001）。

OsDREB2A和SOS1是分別從水稻和擬南芥中發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)抗鹽基因。Zhu和Wu（2008）分別以這兩個(gè)基因作為選擇標(biāo)記，構(gòu)建載體 pZWOsDREB2A-cyc和 pZWAtSOS1-cyc，在含 200 mmol·L-1NaCl的培養(yǎng)基上對(duì)水稻進(jìn)行轉(zhuǎn)化并篩選。通過(guò)鹽篩選系統(tǒng)的選擇很安全，不僅能獲得轉(zhuǎn)基因植株，還可以獲得耐鹽脅迫的新材料。

2.2 標(biāo)記基因刪除法

該方法主要是利用常規(guī)的抗性選擇標(biāo)記篩選出轉(zhuǎn)基因植株，然后通過(guò)轉(zhuǎn)基因后代遺傳重組使選擇標(biāo)記和目的基因分離，或者是利用位點(diǎn)特異性酶將選擇基因剔除而獲得無(wú)抗性選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株。常見(jiàn)有共轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)座子、同源重組和位點(diǎn)特異性重組。該方法尚處于開(kāi)發(fā)階段，試驗(yàn)對(duì)象也僅是煙草、擬南芥等模式植物。

2.2.1 共轉(zhuǎn)化 共轉(zhuǎn)化是將標(biāo)記基因和目的基因分別構(gòu)建在不同的載體上或者同一載體的不同T-DNA區(qū)域內(nèi)，共同轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞后通過(guò)分子鑒定獲得共整合植株，后代經(jīng)遺傳重組使標(biāo)記基因和目的基因分離，并選擇只含有目的基因的轉(zhuǎn)化植株。共轉(zhuǎn)化需要后代遺傳分離來(lái)剔除標(biāo)記基因，因而適合有性繁殖的植物，但DNA直接轉(zhuǎn)移獲得T-DNA容易緊密連鎖（Ebinuma et al.，2001b），后代分離也較難獲得標(biāo)記基因分離的植株。具體有 3種途徑：① 用雙菌株轉(zhuǎn)化，每個(gè)菌株含有一個(gè)不同的質(zhì)粒。de Neve等（1997）將分別含有NPTⅡ和hpt的兩個(gè)根癌農(nóng)桿菌菌株混合后侵染擬南芥，其中southern-blot驗(yàn)證有44.4 %的轉(zhuǎn)化植株有T-DNA連鎖，證明了這一途徑的可行性。Mc Knight等（1987）在煙草的轉(zhuǎn)化中也采用了兩個(gè)分別帶有不同基因的農(nóng)桿菌菌株。② 用單菌株轉(zhuǎn)化，菌株含有2個(gè)不同的質(zhì)粒。這種方法較容易分離獲得只含目的基因的轉(zhuǎn)化植株，但因?yàn)?個(gè)菌株內(nèi)含有不同質(zhì)粒容易引發(fā)質(zhì)粒的不相容性，因此要注意質(zhì)粒的選擇問(wèn)題（Daley et al.，1998）。③ 雙 T-DNA法，即將2個(gè)基因整合到同一個(gè)質(zhì)粒上，這一方法較混合菌株的方法轉(zhuǎn)化效率高。Komari等（1996）將標(biāo)記基因NPTⅡ或hpt分別和目的基因GUS構(gòu)建在雙元質(zhì)粒載體的2個(gè)相鄰T-DNA區(qū)域上，對(duì)水稻進(jìn)行侵染，共轉(zhuǎn)化率為47 %。分離后代中有65 %含有GUS，說(shuō)明至少一半以上的共轉(zhuǎn)化植株中雙T-DNA的整合位點(diǎn)不連鎖。Lu等（2001）改進(jìn)了質(zhì)粒的構(gòu)建方法，把2個(gè)獨(dú)立的T-DNA序列改建為含雙右邊界的T-DNA和一個(gè)左邊界的T-DNA序列，用來(lái)轉(zhuǎn)化水稻。

2.2.2 轉(zhuǎn)座子 在玉米中首先發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座子也可以實(shí)現(xiàn)基因重組，如玉米的Ac/Ds轉(zhuǎn)座原件，Ac主要是編碼轉(zhuǎn)座酶用于Ac和Ds基因的轉(zhuǎn)座，Ds兩端各有一個(gè)長(zhǎng)度為數(shù)百個(gè)核苷酸的序列，中間可以插入較大的基因片段，且插入其他基因片段后的 Ds仍然可以同 Ac一起被轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)移（Fedoroff，1989）?；谶@些特性，可以把目的基因置于轉(zhuǎn)座子的外部同時(shí)將標(biāo)記基因插入 Ds內(nèi)部，轉(zhuǎn)化植物后選擇標(biāo)記可以通過(guò)轉(zhuǎn)座作用被轉(zhuǎn)走，而轉(zhuǎn)化后代經(jīng)過(guò)遺傳分離可以獲得無(wú)標(biāo)記的轉(zhuǎn)化植株；也可以將目的基因插入 Ds內(nèi)部，轉(zhuǎn)座酶把目的基因轉(zhuǎn)到染色體組的新位置上后再通過(guò)遺傳分離獲得無(wú)標(biāo)記的轉(zhuǎn)化植株。轉(zhuǎn)座子法已經(jīng)應(yīng)用到了煙草、番茄和水稻上，并獲得了無(wú)標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株（Goldbrough et al.，1993；Sugita et al.，1999；Cotsaftis et al.，2002；金維正 等，2003）。其缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)座后基因還會(huì)重新插入，后代經(jīng)過(guò)有性分離才能獲得無(wú)標(biāo)記植株，因此效率低，且工作量大、周期長(zhǎng)，較適宜有性繁殖且生長(zhǎng)周期短的植物。

2.2.3 同源重組 同源重組發(fā)生在DNA同源序列之間，指同源序列通過(guò)鏈置換和單鏈侵入形成異源雙鏈，通過(guò)一些重組酶修復(fù)可使兩條異源雙鏈發(fā)生交換。將其引入遺傳轉(zhuǎn)化，即在用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株后再設(shè)計(jì)一段同源序列，將標(biāo)記基因置于2個(gè)同源序列之間，通過(guò)DNA重組將含有標(biāo)記基因的DNA序列剔除。Fischer等（1996）曾用此方法轉(zhuǎn)化煙草的葉綠體染色體組，最終獲得了無(wú)標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化植株。同源重組轉(zhuǎn)化法不需要輔助因子參與，也無(wú)需后代的遺傳分離過(guò)程，但在植物的真核基因組中的重組效率較低，報(bào)道甚少。

2.2.4 位點(diǎn)特異性重組 位點(diǎn)特異性重組是指通過(guò)重組酶在DNA特異位點(diǎn)間實(shí)現(xiàn)交換，需要重組酶和其識(shí)別位點(diǎn)。應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，是在標(biāo)記基因的兩端分別插入重組酶的識(shí)別序列，在重組酶的作用下將標(biāo)記基因刪除。常見(jiàn)的重組系統(tǒng)有Cre/LoxP、FLP/FRT、R/Rs、Gin/gix和attP。

2.2.4.1 Cre/LoxP系統(tǒng) Cre/LoxP系統(tǒng)是Sterberg在大腸桿菌噬菌體P1中發(fā)現(xiàn)的，由重組酶Cre和識(shí)別位點(diǎn)LoxP組成。Cre可以識(shí)別34 bp的部分回文的LoxP序列，無(wú)需能量和其他蛋白便可以在體內(nèi)外對(duì)線性和環(huán)狀甚至超螺旋結(jié)構(gòu)的DNA分子進(jìn)行重組（Ow & Medberry，1995）。重組酶可以通過(guò)二次基因轉(zhuǎn)化將重組酶導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植株，也可以通過(guò)與含有重組酶基因的植株雜交導(dǎo)入，在切除標(biāo)記基因后，通過(guò)轉(zhuǎn)化植株后代的分離將重組酶基因剔除，從而獲得無(wú)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植株。比較理想的是誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)與位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)相結(jié)合，將目的基因、標(biāo)記基因和重組酶基因及其識(shí)別序列構(gòu)建在一個(gè)載體上，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在目的基因引入后瞬間表達(dá)重組酶基因，刪除標(biāo)記基因和重組酶基因（Zuo et al.，2001）。Zuo等（2000，2001）構(gòu)建了一個(gè)化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)的位點(diǎn)轉(zhuǎn)移DNA刪除系統(tǒng)PX6-GFP，培養(yǎng)基中的β-雌二醇誘導(dǎo)XVE表達(dá)，啟動(dòng)Cre重組酶基因表達(dá)將識(shí)別序列間的選擇標(biāo)記基因刪除。Hoff利用Cre/LoxP構(gòu)建了pCrox載體，利用熱激啟動(dòng)子HSP81-1啟動(dòng)Cre，以GUS為報(bào)告基因（Hoff et al.，2001）。高尚等（2007）構(gòu)建了NPTⅡ基因可被刪除的和可插入目的基因的通用植物表達(dá)載體pBI121-lox-MCS。這些表達(dá)載體可廣泛用于培育無(wú)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物。

2.2.4.2 FLP/FRT系統(tǒng) 釀酒酵母2μ的環(huán)狀質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的 FLP特異性位點(diǎn)重組酶是首先被用于切除轉(zhuǎn)基因植物中的標(biāo)記基因的，因此 FLP/FRT是最早創(chuàng)建的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)。Cregg和Madden（1989）克隆了酵母的FRTs之間的Arg，將FRTs-ARG+-FRTs結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Arg-酵母中，篩選得到了Arg+轉(zhuǎn)化植株。而后二次導(dǎo)入FLP重組酶，又獲得了Arg-的轉(zhuǎn)化子，證明發(fā)生了重組。后來(lái)Lyznik等（1993）又將該系統(tǒng)應(yīng)用于玉米和水稻的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。單曉昳等（2006）利用多步重組，構(gòu)建了可在植物中廣泛應(yīng)用的FLP/FTR位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)熱激處理后41 %的二次轉(zhuǎn)化植株發(fā)生了標(biāo)記基因的刪除。目前所報(bào)道的植物轉(zhuǎn)基因研究中對(duì)該系統(tǒng)利用時(shí)均采用了二次轉(zhuǎn)化。

2.2.4.3 R/Rs系統(tǒng) 在結(jié)合酵母的環(huán)形質(zhì)粒pSR1中發(fā)現(xiàn)了這一系統(tǒng)（Sugita et al.，1999），包括重組酶R和2個(gè)重組酶識(shí)別位點(diǎn)Rs，在重組酶R的作用下識(shí)別位點(diǎn)Rs間發(fā)生同源重組（Reiner，1975）。Onouchi等（1995）利用含有R重組酶基因的轉(zhuǎn)化植株與位于Rs位點(diǎn)間的插入標(biāo)記基因的植株進(jìn)行雜交，獲得了無(wú)選擇標(biāo)記的擬南芥。Sugita等（2000）把誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)和MAT載體結(jié)合，將R基因構(gòu)建在除草劑“safener”誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子之后，兩側(cè)有重復(fù)序列Rs，獲得了14 %含有GUS的無(wú)選擇標(biāo)記植株，其中多數(shù)為單拷貝整合。

2.2.4.4 Gin/gix系統(tǒng)和attP系統(tǒng) Gin/gix系統(tǒng)是在Mu噬菌體中被發(fā)現(xiàn)的，在重組酶Gin的作用下，兩個(gè)特異性識(shí)別位點(diǎn)gix間的DNA片段發(fā)生剔除（Maeser & Kahmann，1991）。attP系統(tǒng)則是利用了噬菌體能通過(guò)噬菌體附著位點(diǎn)（attP）整合到大腸桿菌基因組的細(xì)菌附著位點(diǎn)（attP）上的原理。Zubko等（2000）發(fā)現(xiàn)在噬菌體的2個(gè)attP位點(diǎn)之間發(fā)生了染色體內(nèi)同源重組而將標(biāo)記基因剔除，且不含INT和IHF蛋白的轉(zhuǎn)化體系。這兩個(gè)系統(tǒng)尚處于待開(kāi)發(fā)和利用的階段，雖然在噬菌體上得以證實(shí)但在高等植物的遺傳轉(zhuǎn)化中缺少應(yīng)用。

3 無(wú)抗性選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因技術(shù)在蔬菜作物上的應(yīng)用

無(wú)抗性選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因技術(shù)是目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)的前沿，在糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物上已經(jīng)展開(kāi)較深入的研究，但在轉(zhuǎn)基因技術(shù)相對(duì)薄弱的園藝作物上應(yīng)用卻非常有限。

與糖類相關(guān)的選擇基因中利用pmi作為選擇標(biāo)記的研究較多。彭世清和陳守才（2005）在番茄的遺傳轉(zhuǎn)化中嘗試建立甘露糖陽(yáng)性選擇系統(tǒng)，構(gòu)建了pmi為選擇標(biāo)記的植物表達(dá)質(zhì)粒載體pPMI并導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，研究甘露糖對(duì)番茄生長(zhǎng)和生根的影響及葉盤對(duì)甘露糖的敏感性。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)番茄，獲得了轉(zhuǎn)化的再生植株，表明以甘露糖為陽(yáng)性選擇系統(tǒng)在番茄遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用是可行的。王達(dá)新（2007）以黃燈籠椒為材料，建立高效的離體再生體系，利用 pBI121和pNOV2819及CMVcp基因構(gòu)建了以pmi為選擇標(biāo)記的pNOVcp植物表達(dá)載體，并通過(guò)其對(duì)甘露糖的抗性選擇試驗(yàn)建立起甘露糖陽(yáng)性篩選遺傳轉(zhuǎn)化體系。同年，Min等（2007）將pmi作為選擇標(biāo)記基因，試圖將GLO和JMT兩基因轉(zhuǎn)入大白菜，通過(guò)在培養(yǎng)基中添加7 g·L-1的甘露糖和2 %的蔗糖對(duì)再生植株進(jìn)行篩選，初步建立了甘露糖陽(yáng)性選擇系統(tǒng)，兩基因的轉(zhuǎn)化率分別為 1.4 %和3.0 %，從而為大白菜轉(zhuǎn)基因研究提供了一條新的途徑。王洪偉（2009）曾通過(guò)攜帶含有pmi質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404侵染番茄子葉外植體，利用甘露糖篩選系統(tǒng)進(jìn)行篩選，共獲得了54株再生植株，PCR初步證明獲得了陽(yáng)性轉(zhuǎn)scFv植株。張海（2009）通過(guò)建立含pmi選擇標(biāo)記的pCAOxOPMI表達(dá)載體導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜，共獲得甘露糖抗性植株14株，PCR檢測(cè)其中11株為陽(yáng)性。對(duì)木糖異構(gòu)酶基因的利用，Haldrup等（1998b）曾將xylA作為選擇標(biāo)記的木糖篩選體系應(yīng)用到番茄的遺傳轉(zhuǎn)化中，較理想的篩選濃度是15 g·L-1的D-木糖，并獲得了初步成功，轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到9%，而用Kam選擇的轉(zhuǎn)化率僅有7 %。崔麗?。?010）以大腸桿菌xylA作為選擇標(biāo)記基因，利用木糖作為選擇劑獲得能夠表達(dá)帶有GUS報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因黃瓜。同時(shí)構(gòu)建了pX390-scFv載體，以木糖作為篩選劑進(jìn)行黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化研究，初步建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基于木糖選擇系統(tǒng)的黃瓜轉(zhuǎn)化體系。

以植物激素相關(guān)基因 ipt為選擇標(biāo)記在園藝作物的遺傳轉(zhuǎn)化上也有成功的報(bào)道。Kunkel等（1999）利用地塞米松（dexamethasone）誘導(dǎo)的啟動(dòng)子使 ipt表達(dá)，在誘導(dǎo)條件下獲得了萵苣的轉(zhuǎn)化植株。Thirukkumaran等（2009）也將該法用于長(zhǎng)壽花的遺傳轉(zhuǎn)化，通過(guò)PCR驗(yàn)證超過(guò)90 %的正常芽為ipt和GUS陰性，這些結(jié)果表明ipt引起的叢生芽現(xiàn)象可以將非轉(zhuǎn)化苗明確區(qū)分。

在刪除選擇標(biāo)記策略中，共轉(zhuǎn)化法在園藝作物上的研究較多。Goldbrough等（1993）利用轉(zhuǎn)座子法把標(biāo)記基因GUS作為報(bào)告基因插入Ds內(nèi)部，通過(guò)轉(zhuǎn)化后代的遺傳分離最終獲得了無(wú)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因番茄植株。張余洋（2006）將位點(diǎn)特異性重組Cre/LoxP化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)應(yīng)用到番茄的遺傳轉(zhuǎn)化研究中，p35G植物載體轉(zhuǎn)化番茄后共得到19個(gè)抗性芽，經(jīng)過(guò)β-雌二醇誘導(dǎo)后有2個(gè)無(wú)抗性標(biāo)記的再生芽可以觀測(cè)到綠色熒光蛋白的表達(dá)，證明該誘導(dǎo)自主剔除系統(tǒng)適用于番茄。

4 小結(jié)與展望

目前，研究人員致力于各種安全標(biāo)記開(kāi)發(fā)和無(wú)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究，主要是為了降低或克服轉(zhuǎn)基因植物的安全性問(wèn)題，避免轉(zhuǎn)基因植物可能給自然環(huán)境帶來(lái)的負(fù)面影響，同時(shí)減少社會(huì)對(duì)于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的顧慮，為其商業(yè)化鋪平道路。盡管這些新方法有著各種各樣的優(yōu)勢(shì)和缺陷，但都證明轉(zhuǎn)基因技術(shù)在日益完善。新技術(shù)已經(jīng)在很大程度上解決了傳統(tǒng)方法利用抗性選擇標(biāo)記對(duì)生態(tài)環(huán)境和食品、藥物安全方面影響的問(wèn)題，更省去了對(duì)抗性標(biāo)記的安全性評(píng)估的過(guò)程。上述無(wú)抗性標(biāo)記轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，pmi、xylA和gpf等安全標(biāo)記已經(jīng)廣為應(yīng)用到植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究中；共轉(zhuǎn)化法則是目前研究較深入且適用面較廣的無(wú)抗性標(biāo)記轉(zhuǎn)基因方法；位點(diǎn)特異性重組法雖然現(xiàn)在尚處于研發(fā)階段，但將來(lái)應(yīng)該是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的重要發(fā)展方向之一。盡管這些新方法的研究已取得了一些成果，但只是在擬南芥、煙草和馬鈴薯上獲得了較大的進(jìn)展，其他植物尤其是轉(zhuǎn)化效率較低的作物首先需要提高轉(zhuǎn)化效率。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研發(fā)及其商業(yè)化在糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物上已經(jīng)取得了一些成果和進(jìn)展，例如水稻、玉米、大豆和煙草。但在蔬菜作物上受到的阻力較大，科研方面取得的研究進(jìn)展就更少。為了發(fā)揮轉(zhuǎn)基因技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，規(guī)避缺陷，發(fā)展出效率更高、更安全、更易操作的轉(zhuǎn)化方法，培育無(wú)抗性選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物將是轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域發(fā)展的必然趨勢(shì)。

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