細菌“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”核酸檢測方法

李 影，王偉利，錢愛東*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，吉林 長春 130062)

自1982年，細菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(Viable but nonculturable state，VBNC)被正式提出至今其研究的實際意義越來越明顯，特別是在食品檢疫、水質(zhì)監(jiān)測等方面尤為突出。隨著研究不斷深入，用于VBNC細菌檢測的技術(shù)種類也越來越多，如基于底物吸收能力的Fouge活菌直接計數(shù)法、氧化還原能力的呼吸檢測法、細胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)完整性的活/死細菌試劑盒檢測法以及其核酸的核酸方法等[1]。然而，由于目前“活細胞”的標(biāo)準(zhǔn)尚未得到充分證明和有效認可，使得這些方法均有一定的適用范圍和局限，也均存在著一定的問題和不足。相比之下，基于核酸的分子生物學(xué)技術(shù)在近幾年發(fā)展迅速，眾多處于VBNC狀態(tài)下的細菌得以準(zhǔn)確而快速檢出。并且在該技術(shù)推動之下，有關(guān)VBNC狀態(tài)的分子發(fā)生機制也得以明確闡述。為此，本文從使用范圍、適用條件、優(yōu)缺點及應(yīng)用等幾方面，對目前在VBNC研究領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的核酸檢測技術(shù)進行評述。

1 VBNC細菌核酸檢測方法建立的前提-確定“活細胞”分子

檢測VBNC細菌時，確定“活細胞”的標(biāo)志是至關(guān)重要的。只有那些可培養(yǎng)細胞數(shù)為零而活細胞數(shù)不為零的細菌才有可能具有VBNC狀態(tài)?？膳囵B(yǎng)數(shù)的測定依照平板計數(shù)法便可完成，但要確定“活細胞”數(shù)，就必須分清具備了何種特性的細胞才算是“活細胞”。在以往研究中，一般認為：能夠保持細胞結(jié)構(gòu)完整(如細胞膜完整)、具有代謝活性(如呼吸運動、吸收生化物質(zhì)等)或者能合成DNA、存在mRNA分子以及VBNC特異性基因等，只要能滿足其中一個標(biāo)準(zhǔn)的細胞即可判定為“活細胞”[2]。顯然，在建立VBNC細菌核酸檢測方法時，RNA或DNA理應(yīng)是最能代表細胞活性狀態(tài)的首選分子。然而，以檢測DNA為基礎(chǔ)的方法盡管特異性較高且簡便省時，但由于DNA分子在死細胞中可長久存在，其檢測的假陽性率也較高。相比之下，以RNA分子，尤其是以mRNA分子為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)是公認的活細胞的信號分子，可排除假陽性的干擾，但由于mRNA分子在VBNC細菌中的豐度偏低，往往有些細菌因轉(zhuǎn)錄不活躍而無法得到有效檢出，而且mRNA不穩(wěn)定，易被核酸酶快速降解，因此該方法的敏感性與特異性均較低[3]。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，無論是以DNA還是以RNA為主建立的VBNC檢測技術(shù)，其技術(shù)缺憾正得到有效彌補和改進，而“活細胞”的判定標(biāo)準(zhǔn)也正必將會被規(guī)范得客觀而精準(zhǔn)。

2 VBNC細菌核酸檢測方法建立的關(guān)鍵-確定VBNC發(fā)生相關(guān)基因

大量研究均已表明，與VBNC發(fā)生相關(guān)的基因是一組基因群，這組基因群因誘導(dǎo)因素的(溫度、營養(yǎng)、pH值、藥物等等)不同而啟動不同的基因，并且不同菌的VBNC發(fā)生相關(guān)基因群亦不相同[4-6]。我們在研究大腸桿菌、沙門氏菌VBNC發(fā)生相關(guān)基因時，亦得出同樣結(jié)論[7-8]。因而，以PCR技術(shù)作為支撐來檢測VBNC細菌的策略便是：在充分比較與篩選的基礎(chǔ)上，確定某幾個基因為VBNC特異性基因之后，再依據(jù)基因設(shè)計特異性引物并建立PCR或RT-PCR方法。獲取特異性基因最直接簡便的方法便是參考和借鑒文獻資料，否則依據(jù)突變體或采用mRNA差異顯示(DDRT-PCR)、消減雜交(SH)、隨機捕獲轉(zhuǎn)錄序列(SCOTS)、雙向蛋白質(zhì)凝膠電泳、基因芯片等確定VBNC發(fā)生相關(guān)基因，將是難度高、工作量極大的工作[9]。但是隨著研究的不斷深入，利用上述研究技術(shù)使得某些細菌(如霍亂弧菌)VBNC發(fā)生相關(guān)基因及作用機制得以明確闡述。Abe等利用一種烷化突變劑NTG對霍亂弧菌進行誘變，經(jīng)低溫及寡營養(yǎng)條件誘導(dǎo)后，獲得了VBNC突變株。該突變株具備了在平板上生長繁殖能力，并與正常菌株經(jīng)抑制性消減雜交(SSH)后，最終確定了谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶基因為VBNC發(fā)生相關(guān)基因，由此亦證明了增加谷胱苷肽可延長正常菌的可培養(yǎng)性[4]。Lai等則利用蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳獲得了副溶血弧菌ST550株VBNC狀態(tài)蛋白質(zhì)表達譜，發(fā)現(xiàn)有13種蛋白質(zhì)負責(zé)誘導(dǎo)和維持VBNC狀態(tài)，這些蛋白質(zhì)與DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶、ATP合成酶等密切相關(guān)，而相關(guān)的決定基因也被證實[5]。由此表明，目前確定VBNC相關(guān)基因的最常用方法和策略，便是選擇具有生物學(xué)特征并且功能明確的已知基因作為目標(biāo)基因，根據(jù)目標(biāo)基因在可培養(yǎng)與VBNC狀態(tài)下所呈現(xiàn)的變化或發(fā)揮的作用進行差異篩選，最終確定只能在VBNC狀態(tài)起作用的基因為VBNC相關(guān)基因。

3 基于DNA分子的VBNC細菌PCR檢測方法

該方法優(yōu)點主要表現(xiàn)在：VBNC細菌基因組DNA易提取，而且不易受到外界影響而降解。PCR技術(shù)快速、靈敏、特異，并且操作簡便省時[10]。而在實際應(yīng)用中，該法一個最大的缺憾便是難以排除假陽性的干擾。針對這種缺憾，一些新改進技術(shù)也應(yīng)運而生，如浮選法、增養(yǎng)法等。這些技術(shù)均是借鑒了環(huán)境微生物富集模式，或者以增加培養(yǎng)等方式刺激活細胞中DNA充分活躍地復(fù)制，以此降低死細胞中DNA分子的濃度，將假陽性降至最低，同時又能避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。但對VBNC細菌而言，DNA復(fù)制已經(jīng)減弱，因此培養(yǎng)法不適用于VBNC細菌研究。目前浮選PCR技術(shù)已在肉品中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌[11]和空腸彎曲桿菌[12]VBNC狀態(tài)檢測時得到很好應(yīng)用，尚不具有普遍性。只有目標(biāo)菌的浮力密度數(shù)值范圍適當(dāng)，該法才可適用。該方法的原理主要是依據(jù)樣品中(包括VBNC等活細胞、死細胞、游離的DNA分子及樣品雜質(zhì)等)不同狀態(tài)細胞的浮力密度值，用3種標(biāo)準(zhǔn)浮值溶液對樣品進行前處理并確定各類細胞的浮值數(shù)值。然后再利用密度梯度離心將不同狀態(tài)細胞分離。由于細胞死亡時浮值增加，遠大于VBNC等活細胞，浮于溶液最上層[12]。而VBNC細胞則處于中間層，樣品中的雜質(zhì)處于底層。此外，游離的DNA分子由于沉降速度較慢難以達到中間層，因而也停留于上層。獲取VBNC等活細胞后，再采用定量PCR或即時PCR檢測。實踐證明，該法的優(yōu)點就是能夠有效地區(qū)分活的和死的細胞，將死細胞及游離的DNA分子從檢測體系中清除，避免了PCR反應(yīng)的假陽性。同時VBNC等活細胞又得到富集，從而克服了反應(yīng)的假陰性。另外，該技術(shù)可間接地起到純化DNA作用，排除了樣品雜質(zhì)等抑制PCR反應(yīng)的因素，使檢測方法的靈敏度和特異性得到大幅提升，并且縮短了檢出時間。一般在2個小時內(nèi)便可完成食品中VBNC細菌的檢測。

4 基于mRNA分子的VBNC細菌PCR檢測方法

在不同類型的RNA分子中，rRNA和mRNA現(xiàn)已被認為活細胞的標(biāo)志分子。作為標(biāo)志，mRNA的優(yōu)點在于其穩(wěn)定性差，在細胞易被降解，并且半衰期短，能比較客觀地評價和指示細胞的活性狀態(tài)。但在某些情況，VBNC狀態(tài)下的mRNA豐度極低，不易被檢出，而存在假陰性反應(yīng)。相比之下，rRNA分子在細胞中豐度高，半衰期較長，往往可在死細胞中存留較長時間。盡管能保證檢測的靈敏性，但假陽性反應(yīng)卻無法消除。目前，在VBNC研究領(lǐng)域中，基于rRNA分子的檢測方法主要是DVC-FISH法，即活細胞直接計數(shù)與熒光原位雜交聯(lián)合技術(shù)。該法已在大腸桿菌[13]、幽門螺桿菌[14]等細菌的VBNC狀態(tài)檢測中得到應(yīng)用，但該方法在實際使用時存在如下問題：(1)適用范圍窄。因為DVC法所用的萘啶酮酸僅對G-菌DNA復(fù)制有抑制作用，而對G+菌無作用。(2)存在較高的假陽性反應(yīng)，這是方法難以克服的瓶頸問題。由于rRNA分子在死細胞中也會存在，但目前尚無有效克服或排除假陰性的方法。(3)熒光原位雜交(FISH)固定時往往會對活細胞膜有破壞作用，因而不易于準(zhǔn)確區(qū)分活/死細胞[15]。與之相比，盡管mRNA在VBNC細菌中不穩(wěn)定，豐度低，但是基于mRNA分子的RT-PCR技術(shù)卻已在實際中得到一定應(yīng)用。Narjol等在利用定量RT-PCR評價霍亂弧菌E13083株的tuf、rpoS和relA基因在VBNC狀態(tài)下表達量時證實，VBNC細胞的tuf、rpoS和relA基因表達量分別是對數(shù)期細胞的5500、24和23倍，可用該方法直接檢出VBNC狀態(tài)下的霍亂弧菌[16]。Coutard等則利用RT-PCR技術(shù)分析了處于VBNC狀態(tài)的霍亂弧菌Vp4株的兩種看家基因16S RNA和23S RNA、兩個毒力基因tdh1和tdh2以及rpoS基因，證明16S RNA、23S RNA和rpoS是區(qū)別可培養(yǎng)狀態(tài)與VBNC狀態(tài)的活細胞標(biāo)志，而tdh1和tdh2基因在VBNC階段則不表達[17]。

5 VBNC細菌基因芯片檢測方法

基因芯片是生物高通量檢測技術(shù)的最典型代表，不但可以直接用于VBNC細菌檢測，而且還可以充分了解VBNC狀態(tài)下的基因譜和表達譜，便于建立RT-PCR方法和了解VBNC分子作用機制。Gary等設(shè)計了可檢測來自O(shè)1型霍亂弧菌基因組DNA上的3707個基因的cDNA芯片，并全面比較分析了VBNC與穩(wěn)定期條件下霍亂弧菌的基因轉(zhuǎn)錄情況。經(jīng)檢測，在VBNC狀態(tài)下總共有100個基因被啟動誘導(dǎo)，并經(jīng)定量RT-PCR證實，VC0230[iron(III)ABC transporter]，VC1212(pol)，VC2132(fliG)和VC2187(flaC)等4個基因可作為霍亂弧菌VBNC發(fā)生相關(guān)的特異性基因，可直接用于檢測，即當(dāng)應(yīng)用該芯片檢測時，當(dāng)上述4個基因出現(xiàn)陽性信號，則表明樣品中存在VBNC細胞[18]。Asakura等設(shè)計合成了95個寡核苷酸探針，每個探針均為34～70個不等的多聚體。該芯片除具有種特異性外，還對來自4種霍亂弧菌的毒力、耐藥性、血清型，以及VBNC狀態(tài)進行同時檢測。在利用芯片檢測VBNC細胞時，首先比較了經(jīng)4℃人工海水誘導(dǎo)157 d、76 d和35 d的VBNC細胞與可培養(yǎng)狀態(tài)下正常細胞的mRNA基因表達譜，結(jié)果充分證實了兩種狀態(tài)的差異，可以明顯區(qū)分兩個狀態(tài)，便于VBNC細菌檢測[19]。Liu等根據(jù)17株大腸桿菌的17個rfbE基因和28株大腸桿菌的28個fliC基因序列設(shè)計特異性探針，并研制出了電子芯片。該芯片可以在1L自然水體中檢出VBNC大腸桿菌O157∶H7細胞的最小數(shù)為50個。并經(jīng)RT-PCR共同證實，rfbE和fliC基因是大腸桿菌O157∶H7的VBNC特異性基因，因而該電子芯片可作為自然水體樣品中VBNC大腸桿菌O157∶H7的定量定性分析工具，并且重復(fù)分析使用5次[20-21]。由此表明，VBNC細菌基因芯片檢測方法不但具有高通量、靈敏、特異、快速、準(zhǔn)確，而且還利于VBNC發(fā)生機制研究。但VBNC細菌基因芯片研發(fā)成本昂貴，并且因細菌RNA不穩(wěn)定極易導(dǎo)致檢測結(jié)果重復(fù)性較差。盡管如此，基因芯片作為一個具有良好發(fā)展前景的技術(shù)，必將在未來VBNC細菌檢測中得到更廣泛地應(yīng)用[22-23]。

6 結(jié)語

針對活細胞分子的各類檢測技術(shù)是建立VBNC細菌檢測方法的前提，但并非所活細胞檢測方法都適用VBNC細菌。因此，在建立VBNC細菌檢測法時，尚需在確定活細胞分子標(biāo)志后，再確定活細胞基因，并且該基因應(yīng)為VBNC狀態(tài)所表現(xiàn)的相關(guān)基因而非可培養(yǎng)狀態(tài)下啟動的基因，也就是說應(yīng)為能代表和體現(xiàn)VBNC狀態(tài)的特異性活細胞基因。綜上所述，建立VBNC細菌核酸檢測方法的總體思路為：首先，確定待檢菌是否具有培養(yǎng)能力；其次，利用Live/Dead試劑確定待檢菌的細胞活性；再次，選定待檢的活細胞分子和待檢菌的VBNC狀態(tài)的特異性活細胞基因；最后，基于DNA或mRNA分子，與VBNC發(fā)生相關(guān)基因共建核酸檢測方法。

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