牛肌肉生長(zhǎng)抑制素基因的研究進(jìn)展

黎仁軍,苗永旺

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201)

肌肉生長(zhǎng)抑制素(Myostatin,MSTN)又稱GDF-8(grow th differentiation factor 8,生長(zhǎng)分化因子8),屬 TGF-β(transforming growth factor beta,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β)超家族,是在骨骼肌中廣泛表達(dá)的一種糖蛋白,其生物學(xué)功能變化會(huì)通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá),改變肌肉的纖維組成并造成肌肉重量的變化。肌肉生長(zhǎng)抑制素基因是由美國(guó)John Hopkins大學(xué)醫(yī)學(xué)院Mepherron和Lee等的研究小組在研究轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β家族時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種生長(zhǎng)分化因子[1]。Kambadur發(fā)現(xiàn)雙肌牛中MSTN基因發(fā)生突變,結(jié)果在同樣喂食條件下,雙肌牛比普通牛多提供30%的肉產(chǎn)品[2]。由于GDF-8對(duì)骨骼肌的生長(zhǎng)具有負(fù)調(diào)控作用,所以又命名為肌生成抑制素。該因子在生物醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)等具有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值,所以一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就受到科學(xué)工作者的廣泛重視,現(xiàn)而今已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

1 MSTN基因的發(fā)現(xiàn)

早在十九世紀(jì)人們就發(fā)現(xiàn)了具有雙肌性狀的牛,由于這種牛具有瘦肉率高、屠宰率高等特點(diǎn),因此人們對(duì)雙肌性狀的起因、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、遺傳機(jī)制等進(jìn)行了相關(guān)的研究。直到1997年,McPherron等通過篩選小鼠的骨骼肌cDNA文庫而得到全長(zhǎng)的cDNA序列,分析得出小鼠MSTN基因cDNA序列中只有一個(gè)開放閱讀框架(opening reading frame,ORF),編碼376個(gè)氨基酸,具有TGF-β超家族的典型結(jié)構(gòu),但與其它 TGF-β家族成員的同源性很低(最高為45%),因而被歸為新一類命名為GDF-8[1,3,4]。利用基因敲除技術(shù)使小鼠的GDF-8的C-端生物活性區(qū)缺失,得到的缺失純合體小鼠可以存活并能夠生育,其體重要比雜合型和野生型小鼠重約30%,單塊肌肉的重量為野生型小鼠的2～3倍[5]。因此根據(jù)該基因具有抑制肌肉發(fā)育的功能和表達(dá)的組織特異性,將其命名為肌肉生長(zhǎng)抑制素基因[6]。

2 MSTN基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

MSTN基因編碼的蛋白質(zhì)是TGF-β的一員,它具有TGF-β超家族的典型結(jié)構(gòu)特點(diǎn):其氨基酸序列有家族特征,在MSTN蛋白的N-末端有相同的非親水性氨基酸序列作為分泌信號(hào);一般有9個(gè)半胱氨酸位于C-末端形成“半胱氨酸節(jié)點(diǎn)”;其C-末端通過形成二硫鍵組成具有生物學(xué)活性的二聚體發(fā)揮其功能且C-末端都有保守的由四個(gè)氨基酸Arg-Ser-Arg-Arg(RSRR,第263～266位)組成的蛋白酶加工位點(diǎn)[7]。

迄今為止,已經(jīng)通過染色體遺傳和物理圖像分析對(duì)牛的MSTN基因進(jìn)行了染色體定位,該基因位于:牛2q11[8,9]。牛MSTN基因第1和第2外顯子的長(zhǎng)度分別為506 bp和374 bp,第3外顯子的長(zhǎng)度由于poly(A)尾巴位點(diǎn)的不同而有所差異,分別為1 701,1 812或1 887個(gè)核苷酸,兩個(gè)內(nèi)含子的長(zhǎng)度分別為1 840 bp和2 033 bp[10]。Marcq等分析了比利時(shí)Texel(特塞爾綿羊)雙肌綿羊的遺傳機(jī)制,其MSTN基因的編碼區(qū)與普通綿羊沒有堿基差異。采用該基因側(cè)翼的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析表明,在綿羊染色體2遠(yuǎn)端區(qū)存在1個(gè)對(duì)肌肉的發(fā)育產(chǎn)生效應(yīng)的 QT L(quantitative trait loci,數(shù)量性狀位點(diǎn)),該座位很可能就是MSTN基因。劉錚鑄[5]利用PCR方法擴(kuò)增得到了山羊的MSTN基因5 211 bp的DNA序列,包括了該基因的完整編碼區(qū)。有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子,外顯子的大小分別為:373 bp、374 bp 、381 bp;內(nèi)含子分別 為 1 834 bp 、2 027 bp。

3 MSTN基因的作用機(jī)制

在哺乳動(dòng)物中,MSTN主要在骨骼肌中表達(dá),并且在生長(zhǎng)時(shí)期和成熟期的骨骼肌中均有表達(dá)。和其他TGF-β成員一樣,MSTN基因也是先合成前體蛋白,經(jīng)二次蛋白酶酶解活化,將MSTN基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到胞外,之后形成的前肽在RSRR區(qū)被切除N端約266個(gè)氨基酸,剩成熟區(qū)109個(gè)氨基酸以二硫鍵的方式結(jié)合成二聚體,再和膜上的特異性受體發(fā)生作用,通過三種Smad蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein)介導(dǎo),將信號(hào)傳到細(xì)胞核,最后調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)從而對(duì)骨骼肌纖維數(shù)量和粗細(xì)進(jìn)行調(diào)節(jié)。

為了驗(yàn)證MSTN具有抑制肌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,Taylor[11]等在2001年研究檢測(cè)了重組MSTN基因?qū)κ蠊趋兰〖?xì)胞的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組MSTN基因編碼的蛋白可抑制細(xì)胞的增生、DNA的合成以及蛋白質(zhì)的合成,從而抑制肌肉的生長(zhǎng)。2002年Langley[12]等探討了MSTN基因抑制成肌細(xì)胞分化,并闡述了這種抑制作用是通過Smad3介導(dǎo)的。體外實(shí)驗(yàn)向低血清濃度培養(yǎng)的成肌細(xì)胞中增加MSTN融合蛋白可以可逆的阻斷成肌細(xì)胞的分化。分析表明MSTN可以使MyoD(Myogenic Differentiation Antigen,成肌分化抗原),Myf5(Myogenic regulatory factor 5,成肌調(diào)節(jié)因子5)和Myogenin(肌細(xì)胞生成素)等肌肉調(diào)節(jié)因子水平下降,從而抑制成肌細(xì)胞的分化。

4 MSTN基因的研究進(jìn)展

4.1 MSTN基因的表達(dá)研究

MSTN基因在動(dòng)物的不同發(fā)育時(shí)期和不同物種間的表達(dá)不同,在哺乳動(dòng)物中,MSTN在胚胎發(fā)育時(shí)期和成年個(gè)體骨骼肌中均有表達(dá)。在牛胚胎中,從第15 d到第29 d都能檢測(cè)到少量MSTN基因的mRNA,但是第31 d后mRNA的量會(huì)逐漸增加。Ferec[14]等運(yùn)用定量RT-PCR技術(shù)分析了初生牛中該基因的表達(dá),在股二頭肌和半肌腱中該基因在出生后1 d表達(dá)水平最高,第8 d和第14 d后慢慢降低。而在排腸肌中該基因在出生后第14 d表達(dá)水平最高,第8 d后最低。除了在骨骼肌中有表達(dá)外還發(fā)現(xiàn)其他組織中也有MSTN基因的表達(dá),只是含量較低。Sharma[13]等發(fā)現(xiàn)在牛和綿羊的心肌組織中檢測(cè)到MSTN蛋白。在脂肪組織發(fā)現(xiàn)也有表達(dá),暗示其可抑制前成脂肪細(xì)胞(preadipocyte)分化[14]。Casas[15]等研究了從比利時(shí)蘭牛與MARCⅢ(1/4Angus,1/4Hereford,1/4Red poll,1/4Pinzgauer)的雜交牛、皮埃蒙特(Piedmontese)與安格斯(Angus)的雜交牛這兩個(gè)半同胞家系中分離出MSTN的純化拷貝型與數(shù)量性狀座位的互作效應(yīng),發(fā)現(xiàn)5號(hào)染色體與肌肉的剪切嫩度有關(guān),14號(hào)染色體與脂肪厚度有關(guān)。郭丹[16]等采用PCR-SSCP方法對(duì)草原紅牛(Grassland Red)和利木贊牛(Limousin)與草原紅牛的雜交牛進(jìn)行了單核苷酸多態(tài)性分析,發(fā)現(xiàn)282位堿基發(fā)生突變,由C突變?yōu)锳,導(dǎo)致編碼的氨基酸由苯丙氨酸變?yōu)榱涟彼?這與Grobet于1998年發(fā)現(xiàn)歐洲利木贊牛的MSTN基因第1外顯子的突變相符。并且檢驗(yàn)了不同性狀在該點(diǎn)不同基因型間的顯著性,結(jié)果表明等位基因B可以顯著的提高草原紅牛的日增重、屠宰率、凈肉率和肉骨比。

4.2 MSTN基因的突變及多態(tài)性研究

以產(chǎn)肉多而聞名的比利時(shí)蘭牛(Belgian blue)和皮埃蒙特牛中雙肌表型發(fā)生頻率最高,其中比利時(shí)蘭牛該基因在第3外顯子存在l1個(gè)堿基(937～947)的缺失,造成移碼突變,使得從缺失后面的第14個(gè)密碼子開始停止翻譯,其結(jié)果是C-端僅7個(gè)氨基酸得到翻譯,其余102個(gè)氨基酸(274～375)全部缺失,翻譯出的是一個(gè)截?cái)嗟鞍锥ヒ种萍∪馍L(zhǎng)的作用。雙肌表型的皮埃蒙特牛中MSTN基因也發(fā)生了2個(gè)突變,一個(gè)突變位點(diǎn)位(G※A)于第3外顯子,結(jié)果導(dǎo)致保守的半胱氨酸(Cys)被酪氨酸(Tyr)所取代,使得肌肉生長(zhǎng)抑制素的功能全部或幾乎全部喪失。經(jīng)Southern雜交分析表明,比利時(shí)蘭牛和皮埃蒙特牛均為突變純合子。另一個(gè)突變?cè)诘?外顯子上(C※A),結(jié)果導(dǎo)致亮氨酸(Leu)變?yōu)楸奖彼?Phe)。分析表明,未在皮埃蒙特牛中檢出突變,只在紅安格斯牛(Red Angus)中發(fā)現(xiàn)1例比利時(shí)蘭牛型突變的雜合子,說明該基因的突變是造成雙肌的原因之一[2,17]。從功能上看,雙肌牛中MSTN基因的突變導(dǎo)致該基因產(chǎn)物活性喪失,分子活性區(qū)域消失,結(jié)果肌肉大量增加,使飼料轉(zhuǎn)化效率提高。不利的效應(yīng)是母牛的生育能力下降,犢牛的成活率降低以及性成熟延遲,還會(huì)使牛肉的肌間脂肪及結(jié)締組織減少,機(jī)體內(nèi)部器官重量減輕等[18]。Bellinge[19]等在牛MSTN基因編碼區(qū)共發(fā)現(xiàn)9種能產(chǎn)生非同義密碼子的突變,其中3種為錯(cuò)義突變,包括外顯子1中2種和外顯子2中1種。另外6種突變位于外顯子2和外顯子3,導(dǎo)致提前形成終止密碼子,致使蛋白失活,從而失去了對(duì)肌纖維生長(zhǎng)發(fā)育的抑制作用。Grobet[20]等檢測(cè)了10個(gè)歐洲牛品種的32頭雙肌牛,發(fā)現(xiàn)了7個(gè)DNA多態(tài)型,其中5個(gè)推測(cè)造成了蛋白質(zhì)功能的改變,1個(gè)為保守氨基酸替換,另一個(gè)為沉默DNA突變,在內(nèi)含子中檢出了4個(gè)DNA多態(tài)型,除2個(gè)品種外,其它品種的雙肌牛均為5個(gè)功能缺失突變體之一的復(fù)雜雜合子或是純合子,缺少明顯功能突變的其它2個(gè)品種推測(cè)在基因的未測(cè)片段有另外的突變或是雙肌牛的位點(diǎn)異質(zhì)性所致 。史明艷[21]等對(duì)南陽牛和秦川牛的MSTN基因全序列研究結(jié)果表明:45頭南陽牛種只有第三外顯子938位堿基處發(fā)生了G※A的突變,而30頭秦川牛中沒有突變。常春芳[22]等對(duì)4個(gè)品種66個(gè)樣本MSTN基因外顯子2序列分析結(jié)果表明:18個(gè)雷瓊牛樣本沒有發(fā)生變異,多態(tài)性較貧乏,18頭蒙古牛有1個(gè)變異位點(diǎn),牦牛有2個(gè)變異位點(diǎn),而12頭獨(dú)龍牛有1個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變異。冀德君[23]等在18頭蒙古牛樣本中檢測(cè)到1個(gè)核苷酸多態(tài)位點(diǎn),含有兩種核苷酸類型。在19頭海子水牛樣本中檢測(cè)到3個(gè)核苷酸多態(tài)位點(diǎn)以及2種基因單型。Li[24]等測(cè)定了24個(gè)山羊品種、8個(gè)綿羊品種MSTN基因部分內(nèi)含子2序列,發(fā)現(xiàn)7個(gè)多態(tài)位點(diǎn),屬于完全連鎖平衡,能劃分出3個(gè)單倍型。在綿羊品種中未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)。Clop[25]等發(fā)現(xiàn)雙肌羊 Texel是由于MSTN基因3'UTR(Untranslated Regions,非翻譯區(qū))發(fā)生了1個(gè)點(diǎn)突變,產(chǎn)生miR1和miR206兩種骨骼肌表達(dá)的microRNAs,抑制MSTN基因的翻譯,從而導(dǎo)致Texel肌肉肥大的性狀。

4.3 MSTN基因的基因敲除研究

采用基因打靶技術(shù)人工剔除MSTN基因,獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究已取得較大進(jìn)展,如剔除MSTN基因的小鼠。目前以體細(xì)胞MSTN基因敲除生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因牛、羊的研究工作都正在進(jìn)行中。2011年孫丹[26]等利用LA-PCR技術(shù),對(duì)分子克隆連接技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化,最大可能獲取長(zhǎng)片段基因序列作為同源臂,應(yīng)用基因打靶技術(shù)體外構(gòu)建針對(duì)綿羊MSTN基因第3外顯子的基因打靶載體,使綿羊體內(nèi)MSTN基因失活,以達(dá)到提高產(chǎn)肉量的目的。李湘萍[27]等對(duì)綿羊體細(xì)胞MSTN基因進(jìn)行敲除實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明對(duì)綿羊成纖維細(xì)胞進(jìn)行基因修飾是可行的。

5 MSTN基因的應(yīng)用前景

MSTN基因是繼生長(zhǎng)激素(GH)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFs)之后新發(fā)現(xiàn)的功能基因,由于該基因是骨骼肌生長(zhǎng)抑制因子,通過對(duì)該基因的研究,基因突變是引起雙肌性狀的重要原因之一已經(jīng)很明確了,這就為增加動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)肉量提供了一種方式和途徑,為動(dòng)物育種學(xué)家提供了一種新思路。于是國(guó)內(nèi)外學(xué)者試圖通過基因敲除和轉(zhuǎn)基因等方法達(dá)到增加肉產(chǎn)量和提高肉品質(zhì)的目的,若能利用基因敲除技術(shù)能在?；蜓虻戎匾馊菁倚笊锨贸齅STN基因而產(chǎn)生骨骼肌明顯增大的品質(zhì),這將具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。另外也可以在畜牧業(yè)上可以篩選MSTN基因突變的個(gè)體,通過育種培育出產(chǎn)肉率高的優(yōu)良品種。此外,利用基因重組技術(shù)可以獲得MSTN基因缺失的動(dòng)物,或通過篩選MSTN基因的抗體或抑制劑,使之與MSTN基因結(jié)合,滅活其功能,從而進(jìn)一步開發(fā)安全可靠的新型飼料添加劑,為生產(chǎn)放心肉提供新的途徑。

[1] Alexandra C,Mcpherron,Ann M,et al.Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-p superfamily member[J].Nature,1997,387:83-90.

[2] Kambadur R,Sharma M,Smith T,et al.Mutations in myostatin(GDF8)in double-muscled Belgian Blue and Piedmontese cattle[J].Genome Research,1997,7(9):910.

[3] Mcpherron A C,Lee S J.Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene[J].Proceedings of the National A-cademy of Sciences of the United States of America,1997,94(23):12457.

[4] Mcpherron A C,Lee S J.The transforming growth factor[beta]superfamily[J].Grow th facto rs and cytokines in health and disease,1996,1:357-393.

[5] 劉錚鑄.山羊肌肉生長(zhǎng)抑制素基因多態(tài)性及其與生產(chǎn)性能相關(guān)性研究[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[6] 姜運(yùn)良,連正興,李 寧,等.肌肉生長(zhǎng)抑制素基因的研究進(jìn)展[J].遺傳,2000,22(2):119-121.

[7] 張利媛,岳文斌.MST N基因的研究進(jìn)展[J].草食家畜,2006,(3):1-4.

[8] Sonstegard T S,Rohrer G A,Smith T.Myostatin maps to porcine chromosome 15 by linkage and physical analy ses[J].Animal genetics,1998,29(1):19-22.

[9] Smith T,Lopez-Corrales N L,Kappes S M,et al.Myostatin maps to the interval containing the bovine mh locus[J].Mammalian Genome,1997,8(10):742-744.

[10] 孟詳人,馬月輝,葉紹輝.肌肉生長(zhǎng)抑制素基因的研究進(jìn)展[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào),2007,28(4):1-4.

[11] Taylor W E,Bhasin S,Artaza J,et al.M yostatin inhibits cell proliferation and protein sy nthesis in C2C12 muscle cells[J].American Journal of Physiology-Endocrinology And Metabolism,2001,280(2):221.

[12] Langley B,Thomas M,Bishop A,et al.Myostatin inhibits myoblast differentiation by down-regulating MyoD expression[J].Journal of Biological Chemistry,2002,277(51):49831.

[13] Sharma M,Kambadur R,Matthews K G,et al.Myostatin,a transforming g rowth factor-βsuperfamily member,is expressed in heart muscle and is upregulated in cardiomyocy tes after infarct[J].Journal of cellular physiology,1999,180(1):1-9.

[14] Kim H S,Liang L,Dean R G,et al.Inhibition of preadipocyte differentiation by myostatin treatment in 3T3-L1 cultures[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2001,281(4):902-906.

[15] Casas E,Stone R T,Keele J W,et al.A comprehensive search for quantitative trait loci affecting growth and carcass composition of cattle segregating alternative forms of the myostatin gene[J].Journal of animal science,2001,79(4):854.

[16] 郭丹,曹 陽,張嘉保,等.草原紅牛 MSTN基因第一外顯子SNPs多態(tài)性分析[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2007(11):12-14.

[17] Grobet L,Martin L,Poncelet D,et al.A deletion in the bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype in cattle[J].Nature genetics,1997,17(1):71-74.

[18] Mcpherron A C,Lee S J.Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene[J].Proceeding s of the National Academy of Sciences of the United States of America,1997,94(23):12457.

[19] Bellinge R,Liberles D A,Iaschi S,et al.Myostatin and its implications on animal breeding:a review[J].Animal Genetics,2005,36(1):1-6.

[20] Grobet L,Poncelet D,Royo L J,et al.M olecular definition of an allelic series of mutations disrupting the myostatin function and causing double-muscling in cattle[J].Mammalian genome,1998,9(3):210-213.

[21] 史明艷,昝林森,李保蘭,等.牛Myostatin基因單核苷酸多態(tài)性分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2005,21(6):24-25.

[22] 常春芳,冀德君,常洪,等.中國(guó)4個(gè)牛種MSTN基因外顯子2多態(tài)性分析與其系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(14):5790-5791.

[23] 冀德君,常洪,常春芳,等.蒙古牛 MSTN 基因序列分析及多態(tài)性研究[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào),2008,29(1):21-24.

[24] Li X L,Wu Z L,Liu Z Z,et al.SNP identification and analysis in part of intron 2 of goat M ST N gene and variation within and among species[J].Journal of Heredity.2006,97(3):285.

[25] Clop A,Marcq F,Takeda H,et al.A mutation creating a potential illegitimate microRNA target site in the myostatin gene affects muscularity in sheep[J].Nature genetics.2006,38(7):813-818.

[26] 孫丹,金 梅,杜立新,等.綿羊Myostatin基因敲除載體的構(gòu)建[J].生物技術(shù)通報(bào),2011,(5):93-97.

[27] 李湘萍.綿羊體細(xì)胞 my ostatin基因敲除及定點(diǎn)整合 mAA T基因的初步研究[D].廣西南寧:廣西大學(xué),2002.