食源性致病菌活菌檢測技術(shù)研究進展

邱 楊，田 聰，余以剛，肖性龍，李聰聰，劉建麗，趙 麗，梅艷群

（1.東莞出入境檢驗檢疫局，廣東東莞 523072； 2.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州 510640）

近年來，國內(nèi)外食源性疾病事件頻頻發(fā)生，對食源性疾病的預(yù)防與控制已引起了世界各國關(guān)注。提高食源性致病菌活菌檢測方法的速度、效率和靈敏度盡管不能完全解決食品安全問題，卻可以起到預(yù)防與控制食源性疾病的作用。在自然環(huán)境中，微生物以多種生理狀態(tài)存在：可培養(yǎng)的活菌，活的非可培養(yǎng)狀態(tài)（VBNC），具有完整結(jié)構(gòu)但無生物活性的死菌（Ghosts）以及細胞膜損傷死菌（Membrane compomised）。如何區(qū)分活菌與死菌，致病菌與非致病菌所造成的污染是有效檢測食源性致病菌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)檢測方法把細菌是否可培養(yǎng)作為判斷的標準，實際操作中可能會發(fā)生漏檢等情況。隨著研究的不斷深入，活菌的快速檢測新技術(shù)不斷出現(xiàn)，人們將細胞是否具有新陳代謝活性進而產(chǎn)生生物活性物質(zhì)，或是是否具有完整的細胞結(jié)構(gòu)作為判斷活菌的標準。下面主要對食源性致病菌活菌檢測最新研究作一概述。

1 以可培養(yǎng)作為活菌標準的檢測方法

傳統(tǒng)培養(yǎng)法被認為是食品檢測的“金標準”，在食品微生物分析中需要多步完成（如前增菌，選擇性增菌，分離純化），再用生物化學，分子生物學檢測進一步確認。

培養(yǎng)法程序繁雜、耗時長，樣本中可能含有雜菌而產(chǎn)生競爭性抑制，或者由于存在干擾性物質(zhì)而使細菌培養(yǎng)不出來，使得陽性檢出率受到很大影響，不能滿足市場快速準確的要求。同時，培養(yǎng)法敏感，但檢測培養(yǎng)法的真正的敏感性和特異性存在著無可靠參比對照系統(tǒng)的困難，也存在對持留菌、休眠菌及代謝異質(zhì)菌無法成功培養(yǎng)的缺陷[1]。

2 以新陳代謝活力作為活菌標準的檢測方法

2.1 ATP生物發(fā)光法

細胞內(nèi)源性ATP含量可以反映細胞的活性和活細胞的數(shù)量。微生物細胞釋放出的ATP與熒光素在鎂離子和螢火蟲熒光素酶的催化作用下可以產(chǎn)生熒光，熒光強度與ATP含量成正比。同時ATP含量與活的微生物數(shù)量直接相關(guān)，通過熒光檢測儀可以利用發(fā)光強度來間接測定活菌總數(shù)。唐倩倩等[2]建立了E.coliO157:H7與光源計數(shù)值的定量線性模型，證明ATP生物發(fā)光法與傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)方法有良好的線性，相關(guān)性，R2=0.9608，P<0.001。ATP生物發(fā)光法檢測限比一些致病菌的致病濃度高，免疫磁分離技術(shù)與ATP生物發(fā)光法相結(jié)合可以提高檢測的靈敏度，這種方法當前已經(jīng)成為研究熱點。

由于ATP生物發(fā)光法簡單快速，被廣泛的應(yīng)用于食品衛(wèi)生、化工、環(huán)境等領(lǐng)域。但是，ATP生物發(fā)光法只能用于細菌總數(shù)的快速測定，不能用來鑒定菌種。而且，ATP生物發(fā)光法中涉及ATP的提取和酶促反應(yīng)，使得檢測結(jié)果受到多種因素的影響。在檢測實際食品樣品時，食品中含有的其他生物游離出來的ATP可能干擾總ATP含量的測定。另外，緩沖液種類、鹽、pH、溫度等因素對生物發(fā)光反應(yīng)有一定的影響。

2.2 生物傳感器

微生物的代謝過程和基質(zhì)氧化還原機理會產(chǎn)生代謝產(chǎn)物如酶、抗體、色素等可用于檢測和識別的物質(zhì)，或者使培養(yǎng)基的電化學性質(zhì)如電流、電阻和電導等發(fā)生變化，可以檢測分析電化學參量的變化。目前，基于光效應(yīng)、熱效應(yīng)、場效應(yīng)和反應(yīng)物質(zhì)量變化有各種生物傳感器。Su等[3]根據(jù)共振頻率和電阻的變化（△F和△R）利用連有固定化的沙門氏抗體石英晶體微天平（QCM）免疫傳感器檢測沙門氏菌，經(jīng)過阻抗分析儀檢測電導率和電納，結(jié)果表明共振頻率和阻尼的變化與雞肉樣品中鼠傷寒沙門氏菌的濃度相關(guān)，根據(jù)阻尼的變化可以檢測到最低限量為100 cell/mL沙門氏菌。

不同類型的生物傳感器具有各自獨特的優(yōu)點，但又存在各自的局限性。生物傳感器本身不能鑒定菌種，常常需要和其他的檢測方法聯(lián)合使用，基于免疫原理的生物傳感器是當前在利用傳感技術(shù)檢測活菌的研究熱點。隨著技術(shù)的不斷革新，生物傳感器將會成為一種快速檢測微生物的有效手段。

2.3 免疫學技術(shù)

免疫學檢測方法是應(yīng)用免疫學理論設(shè)計的一系列測定抗原、抗體、免疫細胞及其分泌的細胞因子的實驗方法，其基本原理是抗原抗體反應(yīng)。酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)（enzyme-linked fl uorescent immunoassay，ELFIA）是將酶系統(tǒng)與熒光免疫分析結(jié)合起來，在普通酶免疫分析的基礎(chǔ)上用理想的熒光底物代替生色底物。孫素霞等[4]以常規(guī)細菌培養(yǎng)法（GB 4789.30-2003）作為參照，對自動酶聯(lián)熒光免疫分析系統(tǒng)（VIDAS）進行評價，最終根據(jù)熒光計數(shù)儀記錄所產(chǎn)生的熒光強度計算所測物質(zhì)濃度，凍肉李斯特氏菌檢測的靈敏度為100%，特異度為90.9%。

免疫學技術(shù)具有準確性高、檢測速度快等優(yōu)點。但是，單克隆抗體制備比較困難，容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，存在抗體與非抗原物質(zhì)之間的非特異性反應(yīng)，由于靈敏度低，需要經(jīng)過必需的富集步驟。在實際操作中，常常和其他技術(shù)交聯(lián)使用。

2.4 mRNA檢測法

細菌中的DNA是穩(wěn)定的核酸分子，存在平臺效應(yīng)，死菌中的DNA降解較慢，不能作為判斷細菌活的標志。但細菌中mRNA僅存在于活的、有代謝活性的菌體中，在細菌死后很快降解，可以較好地作為活菌的指示標志。李善志等[5]采用以mRNA為基礎(chǔ)的RT-PCR方法對單核細胞增生李斯特氏菌的hlyA基因進行檢測，較好地擴增單核細胞增生李斯特菌的特異性片斷，檢測的靈敏度純菌可達到1×104cfu/mL，人工污染樣品豬肉、蝦肉和牛奶等培養(yǎng)12～16 h，可達4.5 cfu/mL。

近些年還出現(xiàn)不需要溫度循環(huán)儀的核酸等溫擴增方法，如鏈置換擴增法、滾環(huán)擴增法、核酸等溫擴增法等，被應(yīng)用于病原菌診斷、食品致病菌檢測等領(lǐng)域的研究。由于提取RNA比較復雜，且RNA易降解，RNA提取過程中要極力避免外源RNA酶的污染和盡力控制內(nèi)源性RNA酶的活力。以mRNA為基礎(chǔ)的RT-PCR方法不能夠完全區(qū)分死菌與活菌，且檢測靈敏度受到mRNA提取不穩(wěn)定的限制。

2.5 其它檢測法

基于新陳代謝活力檢測活菌的方法還有檢測代謝糖類產(chǎn)CO2的放射測量技術(shù)等其它的技術(shù)。由于化學分析技術(shù)的不斷發(fā)展，分析微生物的特異性化學標志成分的氣相色譜、高效液相色譜、毛細管電泳和質(zhì)譜等儀器分析的方法開始運用于微生物的檢測當中來，在國內(nèi)的應(yīng)用相對較少，有廣闊的發(fā)展空間[6]。

3 以細胞膜完整性作為活菌標準的檢測方法

3.1 死菌/活菌熒光染色技術(shù)

熒光染料由于靈敏度高、操作方便，已作為檢測標記應(yīng)用于活菌檢測。核酸熒光染料種類較多，有DNA染料和RNA染料，有活細胞染料和死細胞染料，還有核酸復染染料等。

Olga等[7]將死菌/活菌熒光染色技術(shù)和熒光原位雜交技術(shù)（LDS-FISH）聯(lián)合使用，檢測水中的Bacteroides spp.存活量，使用SYTOX Green作為熒光染料使16S rRNA染色，利用LDS-FISH法分析混合的微生物菌群中一種目標菌，結(jié)果表明這種方法是一種快速有力的工具檢測飲用水中的活菌數(shù)量，克服了死菌/活菌熒光染色技術(shù)單獨使用不能鑒定菌種的缺陷。

3.2 流式細胞術(shù)

流式細胞術(shù)（flow cytometry）也稱熒光激活細胞分類術(shù)，是一種在功能水平上對單個細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段。李影等[8]用流式細胞儀和熒光染色聯(lián)合對經(jīng)酸和低溫聯(lián)合誘導的大腸桿菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)（VBNC）進行檢測。流式細胞儀分析結(jié)果表明，當可培養(yǎng)菌數(shù)降為零時，與正常狀態(tài)細菌相比，誘導后菌株多數(shù)仍為呈現(xiàn)綠色熒光的活菌，活菌數(shù)遠遠超過死菌數(shù)，結(jié)合熒光圖像可以確知菌體形態(tài)。

流式細胞儀和熒光染色聯(lián)合能夠客觀評價細菌的活性狀態(tài)，較準確地分析出活死細菌的數(shù)量或兩者數(shù)量的比例關(guān)系。但是，流式細胞術(shù)無法鑒定和識別某一具體的微生物。尤其是處于VBNC狀態(tài)的未可培養(yǎng)細菌，流式細胞儀分析樣品所需的熒光染料較多、劑量較大、價格昂貴，不適于大批量樣品的檢測。

3.3 熒光定量PCR法

熒光染料作為前處理手段，結(jié)合qPCR技術(shù)用于活菌檢測已經(jīng)取得大量的研究進展，并且具有廣闊的潛在應(yīng)用空間。EMA是一種選擇性核酸交聯(lián)染料，可以透過死細胞而不能透過活細胞的細胞膜，進入細胞后，EMA與DNA共價結(jié)合，從而阻礙了死細胞中目標DNA的擴增。Andreas等[9]利用EMA對細菌進行預(yù)處理后，分別用微陣列技術(shù)和qPCR技術(shù)檢測活菌數(shù)，并對二者結(jié)果進行比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法都可以有效檢測出樣本中的活菌含量，結(jié)果高度一致。PMA為熒光染料PI的結(jié)構(gòu)類似物，用于活菌/死菌檢測時與EMA的作用原理相似。但是二者穿透細胞的能力有較大區(qū)別。Tomas等[10]利用PMA-qPCR方法定量分析檢測乳制品中的四種乳酸菌，4℃儲存的發(fā)酵牛奶被用來檢測，PMA-qPCR的結(jié)果與平板技術(shù)的結(jié)果很接近（P＜0.05），且檢測可在3 h內(nèi)完成。

利用定量PCR能準確定量、靈敏度較定性PCR明顯提高。但EMA/PMA qPCR法也存在著一些不足和缺陷，對于一些可逆性的部分膜損傷細胞以及部分膜完整的活菌，染料仍會進入細胞，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。與培養(yǎng)法相比，假陽性結(jié)果造成活菌數(shù)量被高估也是主要存在的問題[11]。

4 結(jié)語

食源性致病性活菌檢測技術(shù)在不斷的發(fā)展和創(chuàng)新中，每種方法都有各自的優(yōu)勢，然而隨著技術(shù)的不斷進步，缺陷和不足也逐漸暴露出來。一些技術(shù)的交聯(lián)使用可以克服檢測中的缺陷，國內(nèi)外的研究人員一直在朝著快速、高效、準確、簡便的目的改進和完善已有的檢測方法。隨著科技的進步，將會有越來越多的食品微生物分析方法和技術(shù)應(yīng)用到生產(chǎn)實踐和生活中。

[1]陸宇，朱莉貞，段連山，等.mRNA作為結(jié)核分支桿菌活菌檢測標志的可行性研究[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2003，26（7）：419-422.

[2]唐倩倩，王劍平，蓋玲，等.ATP生物發(fā)光法檢測E.coliO157:H7的研究[J].光譜學與光譜分析，2009，29（2）：309-312.

[3]Su X L，Li Y A.QCM immunosensor for Salmonella detection with simultance measurements of resonant frequency and motional resistance [J]. Biosens Bioelectron，2005，21（6）：840-848.

[4]孫素霞，陳思強，羅海吉.自動酶聯(lián)熒光免疫分析系統(tǒng)檢測凍肉中李斯特氏菌[J].南方醫(yī)科大學學報，2006，26（9）：1325-1326.

[5]李善志，吳清平，張菊梅，等.RT-PCR方法檢測單核細胞增生李斯特活菌研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2006，16（6）：641-643.

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[8]李影，王偉利，段冶，等.流式細胞儀檢測活的非可培養(yǎng)狀態(tài)大腸桿菌[J].中國動物檢疫，2009，26（12）：34-36.

[9]Andreas N，Alberto M，Luke M，et al. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology[J].Journal of Microbiological Methods，2009，76（3）：253–261.

[10]Tomas G C，Raquel T，Carmen P，et al. Simultaneous detection and enumeration of viable lactic acid bacteria and bifid bacteria in fermented milk by using presidium monoazide and realtime PCR [J]. International Dairy Journal，2009，19（6/7）：405-409.

[11]Fittipaldi M，Codony F，Adrados B，et al. Viable Real-Time PCR in Environmental Samples：Can All Data Be Interpreted Directly [J].Microbial Ecology，2011，61（1）：7-12.