免疫分析方法在毒品檢測中的應(yīng)用與進(jìn)展

李 陽，孫杰燕

（中國刑事警察學(xué)院法化學(xué)系，遼寧 沈陽 110035）

免疫分析方法在毒品檢測中的應(yīng)用與進(jìn)展

李 陽，孫杰燕

（中國刑事警察學(xué)院法化學(xué)系，遼寧 沈陽 110035）

文章綜述了免疫分析方法在毒品檢測中的應(yīng)用及其發(fā)展，并分別對放射免疫法、酶標(biāo)免疫分析法、熒光偏振免疫分析法、免疫膠體金技術(shù)在毒品檢測中的應(yīng)用進(jìn)行了論述。

毒品檢測；免疫分析方法

毒品問題已成為全世界面臨的重大社會問題之一，常見的毒品包括安非他明、甲基安非他明、嗎啡、鹽海洛因、蒂芭因、那可汀、罌粟堿和可待因。有關(guān)于毒品檢測的問題迫切需要解決。在毒品分析的過程中，相應(yīng)分析檢測技術(shù)得到了極大的發(fā)展，各種檢測技術(shù)的應(yīng)用為吸毒者的認(rèn)定、戒毒治療過程的監(jiān)測以及以后的監(jiān)督提供了嚴(yán)格的科學(xué)依據(jù)。而國內(nèi)外陸續(xù)報(bào)道關(guān)于毒品的多種檢測方法，多是需要依賴一些價(jià)格昂貴的檢測儀，這就限制了毒品犯罪案件的現(xiàn)場快速檢驗(yàn)。而免疫學(xué)檢測方法恰能在這方面實(shí)現(xiàn)對毒品的檢測。本文對免疫分析方法在毒品檢測中的應(yīng)用與進(jìn)展做一簡要綜述。

1 免疫分析技術(shù)在毒品檢測中的發(fā)展

免疫分析技術(shù)按其在毒品分析中的應(yīng)用和發(fā)展歷經(jīng)了3個階段。酶聯(lián)免疫吸附法是第一代免疫檢測方法。它采用聚苯乙烯微孔板作為包被抗原或抗體的介質(zhì)。檢測時步驟冗長，試劑繁多（包括抗原母液、稀釋液、洗滌母液、底物液、顯色液等），洗滌時微孔板須經(jīng)反復(fù)甩打方可除去孔內(nèi)液體，且操作不方便，容易污染周圍環(huán)境且實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較差。第二代是免疫診斷技術(shù)（滲濾法），出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代末，它以斑點(diǎn)免疫印漬為原理，用印漬紙代替96孔聚苯乙烯微孔板固定抗原或抗體，用疊放于印漬紙下打的吸水紙吸引洗滌液。其法靈敏度和特異性與酶聯(lián)免疫法相似，但抗體用量少，且操作較簡便、快速。但由于免疫診斷的試劑仍存在著需附加幾種試劑的不足，所以在20世紀(jì)90年代又出現(xiàn)了將免疫親和技術(shù)、印漬術(shù)和薄層層析技術(shù)結(jié)合運(yùn)用，用膠體金法研制的一種更加簡便的免疫層析診斷試紙條。使用時，只需把試紙條下端直接插入樣本溶液中，2～5 min即可判斷結(jié)果。此法是目前檢測毒品的最先進(jìn)的免疫學(xué)方法，具有靈敏、特異、簡便、快速、試劑穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，在毒品檢測中有著廣泛的應(yīng)用前景。但其缺點(diǎn)是檢測時待測樣品的濃度、檢測時的溫度等條件將決定膠體金試紙條的靈敏度，仍需進(jìn)一步完善。

2 用于毒品檢測的主要免疫分析技術(shù)

免疫測定法不需要復(fù)雜的樣品前處理程序，簡單、快速，可方便的進(jìn)行篩選和現(xiàn)場分析，其中包括放射免疫分析（RIA）、酶聯(lián)免疫分析（ELISA）、熒光免疫分析（FIA）、金標(biāo)免疫分析等。可供選用的商品化檢測產(chǎn)品也很多。檢測的對象也由原來的尿液擴(kuò)展到唾液、汗液和毛發(fā)。如用放射免疫分析檢測海洛因?yàn)E用者唾液中的嗎啡；采用EIA檢測汗液中的海洛因、嗎啡、6－單乙酰嗎啡和可待因，檢測唾液中的大麻和鴉片；用酶聯(lián)免疫分析方法分析汗液中的嗎啡、可待因等鴉片類毒品；用放射免疫分析法定量分析毛發(fā)中的6－單乙酰嗎啡，當(dāng)濃度大于0.5 ng/mg時，分析結(jié)果與GC/MS分析的一致性較好。其具體應(yīng)用情況如下：

2.1 放射免疫分析（RIA）

放射性免疫法是利用放射性同位素對濫用者的唾液和血液進(jìn)行檢測。其商品試劑盒對于血液中嗎啡的檢出限可以為0.3 ng/mL，這種方法不但準(zhǔn)確性好，而且重現(xiàn)性也高，回收率100 %。且海洛因用量增大，吸毒時間越長，唾液中嗎啡的含量越高，因此放射性免疫法還可以用于海洛因和嗎啡的依賴性診斷。放射性免疫法還可以用來測定毛發(fā)中的嗎啡或可卡因的含量。其可靠性已經(jīng)被氣相色譜－質(zhì)譜方法所證實(shí)。1979年，Baumgartner等人用放射性免疫法成功的測試了吸毒者毛發(fā)中的海洛因及其代謝產(chǎn)物，并由此對吸毒者進(jìn)行了用藥時段的推斷。放射性免疫法分析的靈敏度高，可以直接獲得嗎啡總量，且測定總量可達(dá)到 1～60 ng/mL。采用放射免疫分析法檢測尿中嗎啡濃度，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、所需儀器設(shè)備簡易、試劑較便宜、檢測時間較短等優(yōu)點(diǎn)。通常在收到尿樣后2 h內(nèi)就可得出結(jié)果，一般實(shí)驗(yàn)室均可開展檢測。

2.2 酶免疫分析（EIA）

酶免疫分析是為了克服放射性同位素所引起的危害而發(fā)明的一種使用具有催化活性的生物酶作為免疫反應(yīng)標(biāo)志的一種技術(shù)。主要有兩種常用的酶免疫分析法。

2.2.1 酶聯(lián)放大的免疫測試技術(shù)（EMIT）

此技術(shù)是使用溶菌酶作為連接到所研究藥物上標(biāo)記物的一種免疫分析方法，這種酶能催化某些細(xì)菌細(xì)胞壁膜多糖成分的水解作用。當(dāng)抗體與酶上所連接的藥物作用時，酶就變得沒有活性了，如果樣品中有藥物存在，酶就會被釋放出來，發(fā)生水解作用，并進(jìn)行檢測，其活性就是藥物濃度。此技術(shù)可以用來測定嗎啡、海洛因、可卡因等多種毒品。商品試劑測定可卡因可以達(dá)到0.24 ng/mL。簡便快捷的酶聯(lián)放大免疫測試方法成為現(xiàn)場快速定性檢驗(yàn)的研究方向。

2.2.2 酶聯(lián)免疫吸附測試技術(shù)（ELISA）

酶聯(lián)免疫是目前最流行的一種通用酶標(biāo)記抗體試劑的非均相的免疫分析技術(shù)。早期的酶聯(lián)免疫沿用了放射性免疫法的有限量標(biāo)記抗原或半抗原與樣品分析物共同競爭特異性抗體的概念，現(xiàn)發(fā)展到多種夾心的方法。此方法可以快速、定性檢測血清或尿中的嗎啡，而且具有明確可讀的優(yōu)點(diǎn)。也有有關(guān)ELISA用于大麻和可卡因的報(bào)道，但這種分析方法靈敏度相對較低。

2.3 熒光偏振免疫分析（FPIA）

熒光偏振免疫分析是使用熒光基團(tuán)代替放射性同位素作為標(biāo)記物的分析方法。目前在毒品分析中使用最多的是熒光偏振免疫分析。此技術(shù)制成試劑盒，廣泛用于大麻和可卡因的檢測。如利用熒光免疫分析方法的商品試劑盒，海洛因的檢測血濃度是 345.02±132.60 ng/mL，苯妥英鈉的檢測血濃度是 20.26±17.2 ug/mL。Kraemer等測定了尿液中的安非他命及其代謝物的含量，安非他命的檢出限為50 ug/L，測定結(jié)果與GC－MS方法基本一致。Williams等測定了血液和尿液中的可卡因及其代謝物的含量，方法簡單、快速。Tsatsakis等測定了頭發(fā)樣品中的二苯基海因，并與HPLC方法作了對照，兩種方法的分析結(jié)果非常接近（R＝0.987）。熒光偏振免疫分析方法具有重復(fù)性好，靈敏度和特異性接近色譜分析水平，可實(shí)現(xiàn)快速全自動化等特點(diǎn)，是檢測毒品血濃度的一種快速可靠的免疫分析方法。

2.4 免疫膠體金技術(shù)（ICT）

膠體金是氯金酸在還原劑的作用下，可以聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液，由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。利用膠體金標(biāo)記的單克隆抗體與免疫層析技術(shù)相結(jié)合生產(chǎn)的以試紙條的形式存在的試劑盒已經(jīng)應(yīng)用，其原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維膜的某一區(qū)域，當(dāng)該干燥的硝酸纖維膜一端浸入樣品溶液后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當(dāng)移動到有相應(yīng)抗體的區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，若用免疫膠體金或免疫酶染色可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。曾立波等人研制的氯胺酮膠體金單克隆抗體免疫層析檢測板經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明適用于包括水和多種飲料的不同樣品條件下氯胺酮毒品的現(xiàn)場快速檢測，通過肉眼觀察檢測區(qū)的條帶來確定陽性或陰性，簡單便捷地進(jìn)行定性分析，最低檢測極限可以達(dá)到50 ng/mL。除此之外，還有膠體金標(biāo)記苯丙胺單克隆抗體免疫試劑盒，膠體金標(biāo)記檢測大麻單克隆抗體免疫試劑盒，可卡因及其代謝產(chǎn)物苯甲酰愛康寧膠體金檢測試劑盒。此法具有非常高的靈敏度、特異性很強(qiáng)、簡便、快速、試劑穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，在一些常見毒品的檢測中已廣泛應(yīng)用。但膠體金技術(shù)的缺點(diǎn)是難以進(jìn)行質(zhì)量控制，即使是同一批生產(chǎn)的試劑，也很難保證每個試劑的同一性，因此一般只能用于定性試驗(yàn)，不能進(jìn)行定量分析。

3 分析用樣品的選擇

毒品檢測中的樣品主要有尿樣、血樣（全血、血清或血漿）、汗液、唾液及毛發(fā)等。各樣品中的藥物濃度因毒品使用的方式、時間、劑量及藥物在體內(nèi)的代謝方式不同而不同，檢測時應(yīng)視具體情況而定。譬如血液的檢測窗口期最短，一般只有數(shù)分鐘或幾小時，尿樣的檢測窗口期有2～3 d，通過特殊收集裝置收集的汗液檢測窗口期為數(shù)星期，毛發(fā)和指甲的檢測窗口期最長，一般為數(shù)月或數(shù)年。對大多數(shù)藥物而言，尿樣或血樣中的藥物母體濃度較低，主要是代謝物，如服用嗎啡后僅有 2%～12%無變化的嗎啡自尿中排出，而60%～80%排出的是結(jié)合的代謝物（葡萄糖醛酸結(jié)合物），汗液中的主要分析物是藥物母體，如在服用甲基苯丙胺后，汗液中主要為甲基苯丙胺，只有少部分的苯丙胺。在服用海洛因或可待因后汗液中的主要成分是海洛因、6－單乙酰嗎啡或可待因。毛發(fā)中的藥物形式則主要受藥物整合方式的影響，雖然理論上毛發(fā)是最佳的檢測樣品，具有上述的諸多優(yōu)點(diǎn)，但現(xiàn)在最常用的樣品是尿樣，這主要是因?yàn)槟驑邮占奖闱夷芊从碁E用者當(dāng)時的情況，最符合現(xiàn)場實(shí)際工作的需要。

4 免疫分析方法的選擇

理論上各種免疫分析方法都可用于毒品檢測，具體應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室情況而定。臨床上對免疫反應(yīng)的評價(jià)要求免疫反應(yīng)與生物樣品中的分析物有交叉、在藥物濃度范圍內(nèi)有動力學(xué)曲線，且可準(zhǔn)確地檢測藥物的存在?，F(xiàn)國際上通常用通過氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（GC－MS）得到的接受器操作特征（ROC）曲線來選擇檢測閾值標(biāo)準(zhǔn)以使診斷的靈敏度、特異性和預(yù)測值最優(yōu)化。如國際上規(guī)定可卡因常規(guī)的初篩和確認(rèn)實(shí)驗(yàn)（GC－MS）的閾值是300 ug/L和150 ug/L，大麻是50 ug/L和10 ug/L。分析用樣品主要是尿樣。現(xiàn)在商品化試紙的靈敏度已基本上達(dá)到其他各種檢測方法的靈敏度，而且是單一試劑，一步操作，干燥保存的試劑可在室溫保存1 d以上就可以。缺點(diǎn)是難以進(jìn)行質(zhì)量控制。即使是同一批生產(chǎn)的試劑，也很難保證每個試劑的同一性，因此一般只能用于定性試驗(yàn)。在臨床研究中，對各種免疫分析方法的評價(jià)都以確認(rèn)實(shí)驗(yàn)（如GC－MS、高壓液相色譜法HPLC、薄層色譜法TLC或氣相色譜法GLC等）做對照。

Mule等人曾報(bào)道用放射性免疫法（檢測靈敏度100 ug/L）、TLC（檢測靈敏度1～2 mg/L）、GLC（檢測靈敏度50 ug/L）、EMIT（檢測靈敏度1 mg/L）。同時檢測200例尿樣中的苯甲酰牙子堿，結(jié)果顯示放射性免疫法與GLC的符合率是95.9%，與TLC的符合率是87.0%，與EMIT的符合率是84.5%，Armbruster認(rèn)為EMIT的方法在檢測巴比妥類中優(yōu)于放射性免疫法，在檢測大麻、可卡因和阿片類時比放射性免疫法差。

5 毒品免疫檢測試劑的發(fā)展趨勢

現(xiàn)階段免疫檢測法的局限是單抗及其穩(wěn)定性和生化試劑不能在常溫貯藏下長期保持生物活性問題。因此，單抗的相應(yīng)性質(zhì)的研究和生化試劑的“可逆性固化技術(shù)”及利用物質(zhì)在溫度低于或等于“玻璃態(tài)轉(zhuǎn)換溫度”時會形成并保持玻璃形態(tài)的原理，將酶標(biāo)抗體、蛋白質(zhì)、核酸等活性物質(zhì)制成“玻璃化”產(chǎn)品的研究，將是毒品免疫檢測方法新的研究方向。同時，我們可以預(yù)測在未來的免疫分析法中：化學(xué)發(fā)光免疫分析、生物發(fā)光免疫分析、免疫—場效應(yīng)管傳感器、光纖—免疫傳感器、生物—化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，將隨著科技的發(fā)展逐漸運(yùn)用到毒品的檢測中。

6 結(jié)束語

總之，免疫技術(shù)是一類高特異和靈敏度很好的分析方法。在藥物濫用的檢測、監(jiān)測，藥物在人體中的代謝途徑和代謝水平及其對人體免疫功能的損傷等方面的檢驗(yàn)中都起著極為重要的作用。特別是免疫分析法的應(yīng)用，使快速檢驗(yàn)、現(xiàn)場篩選、多種毒品一次性、快速檢測已成為可能。而這正是公安機(jī)關(guān)偵察破案所需要的，有著不可估量的應(yīng)用前景。

1 李莉、吳福根.毒品的免疫檢測方法研究進(jìn)展［J］.法醫(yī)學(xué)雜志，1997（4）：245～246

2 朱玉軍.生物樣品中常見鴉片類毒品的檢測技術(shù)研究［D］.首都師范大學(xué)，2004

3 張海鵬.免疫分析方法在毒物毒品檢測中的應(yīng)用與進(jìn)展［J］.讀與寫，2008（8）：183

4 Kraemer T, Theis G A,Weber A A, Maurer H H.J.Agric.Food Chem.，2001.49：596～602

5 Williams R H,Maggiore J A,Shah S M,Erickson T B,Negrusz A.J.Anal.Toxicol.，2000.24：478～481

6 Tsatsakis A M,Psillakis T,Paritsis,N.J.Clin.Psychopharmacol.，2000.20：560～573

7 曾立波、陳連康、胡小龍等.膠體金標(biāo)記苯丙胺單克隆抗體免疫試劑盒研究［J］.中國司法鑒定，2007（6）：31

8 彭亦如、林昌銓.免疫分析法在毒品檢測中的應(yīng)用［J］.引進(jìn)與咨詢，2003（3）：39～41

Immunity Analysis Method in Narcotic Examination Application and Progress

Li Yang，Sun Jieyan

The article summarized the immunity analysis method in the narcotic examination application and the development, and to emitted the immunization, the enzyme sign to exempt separately the epidemic disease analytic method, the fluorescence polarization immunity analytic method, the immunity colloid gold technology to carry on the elaboration in the narcotic examination application.

narcotic examination; immunity analysis method

D919.2

A

1000－8136（2011）06－0006－02