• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    肺結核患者外周血單核細胞中差異表達miRNA的篩選

    2011-08-14 04:08:36張立群孫照剛高孟秋馬麗萍吳曉光劉菲
    中國防癆雜志 2011年11期
    關鍵詞:外周血定量肺結核

    張立群 孫照剛 高孟秋 馬麗萍 吳曉光 劉菲

    結核分枝桿菌是導致全球1/3人口感染結核病的致病菌,到目前為止,對它的致病機制還未完全闡明。miRNA是一類廣泛存在于真核細胞當中,長度約20nt的高度保守的微小的RNA分子,通過與對應的靶 mRNA 的3′非翻譯區(qū)(3′untranslated region,3′UTR)的非完全或完全配對結合,阻止其翻譯或破壞其穩(wěn)定性,實現(xiàn)對基因表達的調控。研究表明miRNA在腫瘤、糖尿病和艾滋病等多種疾病中都起著重要作用[1-2]。

    而有關miRNA在結核病發(fā)病機制中的研究卻少有報道。本研究應用miRNAs芯片篩選出肺結核患者和正常人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中差異表達的miRNA,為進一步研究這些差異表達的miRNA在結核病發(fā)病機理中的作用打下基礎。

    材料和方法

    一、研究對象

    肺結核患者共10例,痰抗酸桿菌陽性或臨床及影像學符合肺結核診斷,其中痰集菌(即收集患者24h痰,離心沉渣涂片抗酸染色找結核分枝桿菌)及培養(yǎng)陽性6例,根據(jù)臨床和影像學診斷肺結核4例。其中男6例,女4例,年齡18~55歲,平均年齡(35.2±14.4)歲,這10例患者均初次診斷為肺結核并未經過抗結核治療。正常對照組10名,來自體檢正常人群,結核菌素試驗(PPD)陰性,其中男6名,女4名,年齡20~55歲,平均年齡(28.5±5.2)歲。

    二、實驗試劑

    miRNA分離試劑盒購自美國應用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems),miRNA標記及雜交試劑盒、洗脫緩沖液均購于美國安捷倫公司(Agilent),無RNA 酶的 DNA 酶(RNAsae-Free DNase)購自德國凱奇公司(Qiagen),人miRNA芯片采用安捷倫公司產品(型號G4470B)。

    三、實驗方法

    1.RNA抽提和質量檢測:采集10例肺結核患者及10名正常對照者外周血5ml/人,枸櫞酸鈉抗凝。淋巴細胞分離液分離PBMC,分別將肺結核患者組和健康對照組的PBMC混合,加入Trizol裂解,根據(jù)RNA提取試劑盒(mirVana RNA Isolation Kit,Ambion)的操作步驟提取總RNA和miRNA,采用吸光度(A)值測定和電泳檢測其完整性,紫外分光光度計測定其濃度及純度。

    2.miRNA的標記和純化:按Agilent公司的miRNA完全標記和雜交試劑盒(miRNA Complete Labeling and Hyb Kit)的說明書進行miRNA熒光標記和純化。

    3.芯片雜交、圖像采集和數(shù)據(jù)處理:芯片檢測及分析由美國Agilent公司完成。

    4.實時熒光定量PCR驗證:從有效的差異表達miRNA中選取3個 miRNA,分別為 hsa-miR-1、hsa-miR-146a與hsa-let-7e,進行實時定量 PCR 驗證以確保芯片實驗結果的可靠性。選擇肺結核患者及健康對照者各5例,再次抽取外周血1ml/人,枸櫞酸鈉抗凝。加入Trizol裂解,根據(jù)RNA提取試劑盒(mirVana RNA Isolation Kit)的操作步驟提取總RNA;利用反轉錄試劑盒(miScript Reverse Transcription Kit,Qiagen)將 RNA 逆 轉 錄 為cDNA,反應體系如下:反轉錄緩沖液 (5×)4μl,反轉錄酶1μl,無 RNA酶水14μl,模板 RNA 1μl。反應條件如下:37℃1h,95℃5min。實時熒光定量PCR利用miScript SYBR Green PCR kit(Qiagen)進行,反應體系如下:2×QuantiTect SYBR Green PCR混合液10μl,10×QuantiTect引物2μl,無RNA酶的水7.5μl,cDNA模板0.5μl。反應條件如下:95℃15min,然后是40次循環(huán)的94℃15s、55℃30s和72℃30s。以小核RNA(small nuclear RNA,snRNA)U6作為內參。最后,miRNA的實時定量PCR產物用非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測。miRNA的相對表達量采用2-△△Ct計算。

    四、統(tǒng)計學處理

    芯片結果的統(tǒng)計學意義判斷標準是校正后的兩個樣品間雜交信號強度的比值,以比值>2或<0.15代表有明顯的表達差異。實時定量PCR結果應用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析,對定量資料進行獨立樣本t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結 果

    一、兩組樣品總RNA和miRNA質量檢測結果

    電泳結果顯示,兩組樣品總RNA均可見清晰的18S(S代表沉降系數(shù))和28S條帶,樣品保存質量較好(圖1)。對分離純化獲得的miRNA進行A值測定表明miRNA總量及質量符合miRNA微陣列的檢測要求(表1)。

    圖1 兩組樣品總RNA電泳圖

    二、miRNA在肺結核組和對照組中的表達情況

    對肺結核患者和健康對照者外周血單核細胞中has-miRNAs表達譜數(shù)據(jù)進行分析,芯片數(shù)據(jù)標準化處理后篩選出的26個差異表達的miRNA。在肺結核患者中顯著上調表達13個,下調表達的有13個(表2)。

    表1 RNA樣品基本信息

    表2 芯片數(shù)據(jù)標準化處理后篩選出的26個差異表達的miRNA

    表3 肺結核患者和健康對照組中3個miRNA的表達比較(待測miRNA與內參照U6的Ct值之比,x±s)

    三、實時定量PCR驗證結果

    為了驗證芯片結果的一致性,選取在芯片篩選中有差異表達的 miRNA:hsa-miR-1、hsa-miR-146a與hsa-let-7e進行實時定量PCR驗證。溫度曲線、熔解曲線和電泳結果顯示,反應過程順利,特異性良好,沒有非特異性擴增,表明實時定量PCR結果可靠。歸一化后的結果顯示,hsa-miR-1表達上調,hsa-miR-146a與hsa-let-7e表達下調,與芯片結果一致(表3)。

    討 論

    RNA曾經被認為僅是DNA和蛋白質之間的“過渡”,但越來越多的證據(jù)清楚地表明,RNA在生命進程中扮演的角色遠比人們估計的更為重要。近年的研究發(fā)現(xiàn)miRNA是一種可調節(jié)基因表達、調節(jié)生長發(fā)育和維持機體正常生理功能的一類重要小分子RNA。miRNA廣泛存在于哺乳動物細胞內,具有強大的調控基因表達的作用,miRNA主要采用降解靶mRNA和抑制靶mRNA的翻譯兩種作用方式調控基因的表達[3]。生物信息學研究發(fā)現(xiàn)這些miRNA雖然只占人類基因總數(shù)的2%,卻調控著人類全基因組中30%以上的基因的表達,而且miRNA水平基因調控機制是全新的[4]。隨著新的miRNA的不斷發(fā)現(xiàn),以及部分miRNA功能的明朗,使得miRNA的研究倍受關注,成為當前研究的熱點之一。對于人類基因組來說,在生長發(fā)育、分化和疾病過程中,基因表達的調節(jié)極其復雜,通過多系統(tǒng)相互作用來完成。于轉錄水平的調節(jié)往往比蛋白水平的調節(jié)更快捷且高效節(jié)能。單一miRNA就可以同時調節(jié)眾多的基因,這使得miRNA成為重要生理機能調節(jié)的關鍵因素,如形態(tài)發(fā)生、細胞命運、對感染微生物的反應、著絲粒異染色質結構等。經文獻檢索,國內外尚無關于miRNA在結核感染中作用的研究報道。國內有學者已經開始進行結核患兒循環(huán)miRNA表達譜的研究,另有學者正在進行小RNA在潛伏感染到活動性結核病進程中的作用的研究,但尚無階段性研究結果的報道。

    在本次芯片篩選研究中,在肺結核患者組和健康對照組外周血單核細胞中發(fā)現(xiàn)26個差異表達的miRNA,其中有13個下調,13個上調。說明肺結核患者和健康對照者之間確實存在miRNAs表達差異。從此次的實驗數(shù)據(jù)可以看到,在肺結核患者中高表達的人類來源的miRNAs有miR-21、miR-340、miR-424、miR-301b、miR-1、miR-627等,低表達的人類來源的 miRNAs有l(wèi)et-7e、miR-146a、miR-552、miR-545、miR-136、miR-199a等。

    雖然尚缺少miRNA在結核感染中的研究報道,筆者還不知道上述差異表達的miRNA在結核感染中的作用,但miRNA在免疫和呼吸系統(tǒng)中的研究已有不少報道。在過敏性氣道炎癥的研究中,Ezzie等[5]通過微陣列方法在多西環(huán)素誘導肺特異性IL-13轉基因小鼠(過敏性氣道炎癥)中發(fā)現(xiàn)21個miRNA差異表達。其中miR-21過表達、miR-1低表達。在肺癌的研究中,2004年Takamizawa等[6]首先報道了let-7與肺癌病因學有關,在肺癌組織中44%的患者let-7a表達降低,并與術后生存期縮短相關。2009年美國胸科協(xié)會(ATS)年會上發(fā)表的一篇研究摘要,對不同分期的慢性阻塞性肺疾?。–OPD)患者的肺組織進行了miRNA表達的檢測,校正年齡和吸煙因素后,結果顯示“全球自發(fā)性慢性阻塞性肺疾病組織(GOLD)”定義的1~2期COPD患者肺組織中miR-455和miR-199a表達上調,miR-324-5p和 miR-324-3p表達下降,GOLD 定義的2~4期的COPD患者miR-374表達上調,miR-324-3p表達下調,從GOLD 1至GOLD 4期,miR-374和 miR-199a表達上調,miR-324-3p表達下調[7]。使用Ingenuity Pathway分析軟件,分析miR-324-3p的靶基因及其相關生物路徑反應提示其與分子轉運和細胞發(fā)育、生長、增殖有關;對miR-199a的分析則提示其與細胞間的信號傳遞和組織生長有關,研究者認為不同的miRNA表達譜有助于區(qū)分不同的GOLD分期的COPD患者,并與COPD的發(fā)生發(fā)展密切相關[7]。上述研究提示,筆者篩選出的部分差異表達的miRNA參與了細胞間的信號傳導和細胞的發(fā)育生長和增殖,在結核感染中的作用有待進一步研究。

    特別值得注意的是在肺結核患者中hsa-miR-146a的顯著低表達。目前的研究表明hsa-miR-146a是與免疫相關的miRNA,在免疫系統(tǒng)中miRNA可通過調節(jié)免疫細胞分化、免疫細胞信號轉導、固有免疫應答和適應性免疫應答等多個層面對免疫反應各個水平執(zhí)行較為柔和精細的微調[8]。在固有免疫應答中,Toll樣受體(toll like receptor,TLR)家族是一類近年來研究比較熱門的病原體相關模式受體,TLR與配體結合后首先導致白介素1受體相關激酶1 (interleukin 1receptor associated kinase 1,IRA K1)和腫瘤壞死因子受體相關因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)等接頭蛋白的募集,然后進一步向下級聯(lián)傳導信號,最終通過磷酸化的下游轉錄因子激活包括干擾素在內的大量細胞因子的產生。研究顯示miRNA-146a作為一個負調控分子,其可通過互補結合于IRA K1和TRAF6的 3′端非翻 譯 區(qū) (untranslated region,UTR),在轉錄后水平抑制TRAF6和IRA K1的表達,從而對固有免疫應答中細胞內信號轉導起一種負反饋調節(jié)作用[9]。本研究結果顯示 miR-146a表達水平在肺結核患者中明顯低于正常對照組,提示miR-146a參與了肺結核病的發(fā)生發(fā)展的過程。

    眾所周知,PCR擴增會對芯片結果引入誤差[10],且miRNA的量遠少于RNA。本研究中,為得到足量的miRNA,筆者每組選取了10例(名)受試者,各抽取5ml空腹靜脈血,先將提取的PBMC混合,進而提取總RNA和miRNA,進行芯片實驗?;旌蠘吮镜玫降慕Y果消除了miRNA的個體差異,也有利于消除多次芯片實驗間的誤差。

    筆者將在后續(xù)實驗中針對篩選出來的肺結核差異表達的部分miRNA,在較大的樣本中采用實時定量PCR方法加以驗證,結合患者的臨床病理資料分析其臨床意義,并通過體內外實驗進一步研究相關miRNA的生物學功能。

    [1]Calin GA,F(xiàn)erracin M,Cimmino A,et al.A MicroRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia.N Engl J Med,2005,353 (17):1793-1801.

    [2]Lu J,Getz G,Miska EA,et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers.Nature,2005,435(7043):834-838.

    [3]Rana TM.Illuminating the silence:understanding the structure and function of small RNAs.Nat Rev Mol Cell Biol,2007,8(1):23-36.

    [4]Lewis BP,Burge CB,Bartel DP.Conserved seed pairing,often flanked by adenosines,indicates that thousands of human genes are microRNA targets.Cell,2005,120(1):15-20.

    [5]Ezzie ME,Yu L,Batte K,et a1.A distinct microRNA profile distinguishes GOLD stages in COPD.Am J Respir Crit Care Med,2009,179:A2493.

    [6]Takamizawa J,Konishi H,Yanagisawa K,et al.Reduced expression of the let-7microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival.Cancer Res,2004,64:3753-3756.

    [7]Lu TX,Munitz A,Rothenberg ME.MicroRNA-21is upregulated in allergic airway inflammation and regulates IL-12p35 expression.J Immunol,2009,182:4994-5002.

    [8]Rodriguez A,Vigorito E,Clare S,et al.Requirement of bic/microRNA-155for normal immune function.Science,2007,316(5824):608-611.

    [9]Taganov KD,Boldin MP,Chang KJ,et al.NF-kappaB-dependent induction of microRNA miR-146,an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses.Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(33):12481-12486.

    [10]Sarwal MM.Chipping into the human genome:novel insights for transplantation.Immunol Rev,2006,210:138-155.

    猜你喜歡
    外周血定量肺結核
    顯微定量法鑒別林下山參和園參
    當歸和歐當歸的定性與定量鑒別
    中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:25:44
    愛情是一場肺結核,熱戀則是一場感冒
    海峽姐妹(2018年4期)2018-05-19 02:13:00
    10 種中藥制劑中柴胡的定量測定
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    蒙西醫(yī)結合治療肺結核進展
    疣狀皮膚結核合并繼發(fā)型肺結核1例
    白血病外周血體外診斷技術及產品
    慢性HBV感染不同狀態(tài)下HBsAg定量的臨床意義
    結腸炎小鼠外周血和結腸上皮組織中Gal-9的表達
    慢性蕁麻疹患者外周血IL-17和IL-23的表達及臨床意義
    欧美zozozo另类| 男女国产视频网站| 男人舔奶头视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产片特级美女逼逼视频| 性插视频无遮挡在线免费观看| av免费在线看不卡| 男人舔奶头视频| 高清午夜精品一区二区三区| 高清毛片免费看| 在现免费观看毛片| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 日本黄色片子视频| 精品久久久精品久久久| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 日韩伦理黄色片| 亚洲精品aⅴ在线观看| 一个人看视频在线观看www免费| 国产综合懂色| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美激情在线99| 日韩三级伦理在线观看| 永久免费av网站大全| 看免费成人av毛片| 日韩视频在线欧美| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产男女内射视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 日韩av在线免费看完整版不卡| 夫妻性生交免费视频一级片| 男人添女人高潮全过程视频| 中文字幕免费在线视频6| 久久久久久久大尺度免费视频| 性色avwww在线观看| 国产综合精华液| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲欧美精品专区久久| 欧美日韩综合久久久久久| 欧美一级a爱片免费观看看| 韩国高清视频一区二区三区| 免费观看无遮挡的男女| 国产av不卡久久| 少妇丰满av| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲欧美精品自产自拍| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 精品视频人人做人人爽| 91精品国产九色| 亚洲精品国产av成人精品| 超碰av人人做人人爽久久| 久久6这里有精品| 日本wwww免费看| 日韩欧美 国产精品| 看十八女毛片水多多多| 精品视频人人做人人爽| 熟妇人妻不卡中文字幕| 免费黄色在线免费观看| 日韩免费高清中文字幕av| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲国产欧美在线一区| 精品久久久久久电影网| 久久久午夜欧美精品| 全区人妻精品视频| 亚洲欧美日韩东京热| 可以在线观看毛片的网站| 国产成人a区在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 少妇熟女欧美另类| 亚洲av免费高清在线观看| 好男人视频免费观看在线| 国产高清有码在线观看视频| 国产一区亚洲一区在线观看| av国产免费在线观看| 亚洲av中文av极速乱| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 永久网站在线| 色网站视频免费| 国产毛片a区久久久久| 色5月婷婷丁香| 亚洲性久久影院| 在线播放无遮挡| 久热这里只有精品99| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲图色成人| 日本黄色片子视频| 干丝袜人妻中文字幕| 韩国av在线不卡| 99热这里只有是精品在线观看| 乱系列少妇在线播放| 久久久色成人| 好男人视频免费观看在线| videossex国产| 成人无遮挡网站| 午夜福利视频精品| 18禁在线播放成人免费| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲av福利一区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 免费看av在线观看网站| 特大巨黑吊av在线直播| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 99久久精品一区二区三区| 久久精品国产亚洲网站| 国产片特级美女逼逼视频| 日韩免费高清中文字幕av| 午夜福利视频1000在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 久久6这里有精品| 免费观看无遮挡的男女| 国产免费视频播放在线视频| 日本av手机在线免费观看| 久久久久久久精品精品| 最近中文字幕高清免费大全6| 视频中文字幕在线观看| 舔av片在线| 亚洲精品国产成人久久av| 久久久精品94久久精品| 久久久久久国产a免费观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲国产欧美人成| 日韩av免费高清视频| 亚洲国产欧美在线一区| 男女边吃奶边做爰视频| 国产男人的电影天堂91| 一级毛片 在线播放| 高清日韩中文字幕在线| 一边亲一边摸免费视频| xxx大片免费视频| 国产男人的电影天堂91| 2018国产大陆天天弄谢| 国产成人精品婷婷| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲成人中文字幕在线播放| 精华霜和精华液先用哪个| 精华霜和精华液先用哪个| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产爱豆传媒在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 日韩av在线免费看完整版不卡| 久久99精品国语久久久| av福利片在线观看| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲电影在线观看av| 亚洲熟女精品中文字幕| 高清日韩中文字幕在线| 777米奇影视久久| 国产精品爽爽va在线观看网站| 综合色丁香网| 丝袜美腿在线中文| 免费观看无遮挡的男女| 国模一区二区三区四区视频| 国内精品宾馆在线| 麻豆成人午夜福利视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 人妻系列 视频| 美女视频免费永久观看网站| 欧美丝袜亚洲另类| 91精品国产九色| 久久久久久久大尺度免费视频| av线在线观看网站| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美97在线视频| 国产精品不卡视频一区二区| 国产精品99久久久久久久久| 日本熟妇午夜| 女人久久www免费人成看片| 免费观看在线日韩| 在线观看av片永久免费下载| 精品人妻视频免费看| 高清日韩中文字幕在线| av又黄又爽大尺度在线免费看| 中国三级夫妇交换| 亚洲内射少妇av| 69人妻影院| 高清欧美精品videossex| 少妇人妻精品综合一区二区| 一级av片app| 乱码一卡2卡4卡精品| 久久这里有精品视频免费| 秋霞伦理黄片| 91狼人影院| 岛国毛片在线播放| 欧美日韩综合久久久久久| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲av国产av综合av卡| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产精品一及| 亚洲av.av天堂| 男女下面进入的视频免费午夜| 日日撸夜夜添| 成人国产av品久久久| 日韩在线高清观看一区二区三区| 色5月婷婷丁香| 国产黄片美女视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 三级国产精品欧美在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲精品,欧美精品| 国产一区二区三区av在线| 草草在线视频免费看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 大码成人一级视频| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产亚洲精品久久久com| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久久久久久国产电影| 日本一本二区三区精品| 91精品一卡2卡3卡4卡| 看十八女毛片水多多多| 国产高潮美女av| av国产免费在线观看| 大码成人一级视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲va在线va天堂va国产| 午夜激情福利司机影院| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 岛国毛片在线播放| 国产永久视频网站| av免费观看日本| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 美女cb高潮喷水在线观看| 少妇 在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲欧美成人精品一区二区| 色综合色国产| 全区人妻精品视频| 亚洲精品,欧美精品| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 成人二区视频| 三级经典国产精品| 国产一区二区三区av在线| 777米奇影视久久| 一区二区三区四区激情视频| 免费观看的影片在线观看| 国产精品一区www在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| kizo精华| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产精品成人在线| 色哟哟·www| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 51国产日韩欧美| 国产在线一区二区三区精| 亚洲国产精品999| 成人毛片60女人毛片免费| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久ye,这里只有精品| 色播亚洲综合网| 亚洲人与动物交配视频| 国产乱人偷精品视频| 欧美高清成人免费视频www| 色网站视频免费| av国产免费在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 一本久久精品| 中文字幕制服av| 久久久精品免费免费高清| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产一区二区在线观看日韩| 青春草亚洲视频在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 一级av片app| av专区在线播放| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲av一区综合| 国产美女午夜福利| 欧美一级a爱片免费观看看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品久久久久久精品电影| 校园人妻丝袜中文字幕| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产色爽女视频免费观看| 成年版毛片免费区| 国产亚洲5aaaaa淫片| 久久久国产一区二区| av国产久精品久网站免费入址| 简卡轻食公司| 国产成人a区在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲天堂av无毛| 久久精品综合一区二区三区| 毛片女人毛片| 真实男女啪啪啪动态图| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲av国产av综合av卡| 国产av不卡久久| 男插女下体视频免费在线播放| 嘟嘟电影网在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 寂寞人妻少妇视频99o| 成人国产av品久久久| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 黄色视频在线播放观看不卡| 真实男女啪啪啪动态图| 国产成人精品福利久久| 国产极品天堂在线| 国产成人精品婷婷| 禁无遮挡网站| 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲无线观看免费| 午夜福利在线在线| 久久人人爽人人爽人人片va| 性色avwww在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 国产伦在线观看视频一区| av在线观看视频网站免费| 久久久成人免费电影| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 日韩亚洲欧美综合| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲最大成人中文| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产av不卡久久| 51国产日韩欧美| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 精品人妻偷拍中文字幕| 2018国产大陆天天弄谢| 在线 av 中文字幕| 成人综合一区亚洲| 国产高潮美女av| 国产成人福利小说| av免费观看日本| 欧美一区二区亚洲| 人妻系列 视频| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲精品国产成人久久av| 99热6这里只有精品| 久久这里有精品视频免费| 欧美精品一区二区大全| 亚洲国产欧美人成| 人妻系列 视频| 亚洲国产精品999| 黄片无遮挡物在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 伦精品一区二区三区| 91aial.com中文字幕在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 久久这里有精品视频免费| 午夜福利高清视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 蜜臀久久99精品久久宅男| 91久久精品国产一区二区成人| av在线app专区| 夫妻性生交免费视频一级片| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产精品精品国产色婷婷| 久久久久国产精品人妻一区二区| 中文字幕久久专区| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲内射少妇av| 97精品久久久久久久久久精品| 久久久精品免费免费高清| 日韩av在线免费看完整版不卡| 成人漫画全彩无遮挡| 又爽又黄无遮挡网站| 国产欧美亚洲国产| 爱豆传媒免费全集在线观看| 日本欧美国产在线视频| 中文字幕久久专区| 男女边摸边吃奶| 国产高清国产精品国产三级 | 性插视频无遮挡在线免费观看| 特大巨黑吊av在线直播| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 91精品伊人久久大香线蕉| 欧美xxxx性猛交bbbb| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲av中文av极速乱| 一级二级三级毛片免费看| 亚洲人成网站在线播| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产成人91sexporn| 在现免费观看毛片| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产乱人视频| 欧美性感艳星| 欧美成人午夜免费资源| 老司机影院毛片| 国产一区亚洲一区在线观看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 日韩电影二区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 深爱激情五月婷婷| 中文字幕制服av| 99视频精品全部免费 在线| 欧美精品国产亚洲| 午夜激情福利司机影院| 高清视频免费观看一区二区| 精品国产乱码久久久久久小说| 大片免费播放器 马上看| 国产淫语在线视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 视频中文字幕在线观看| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲电影在线观看av| 亚洲内射少妇av| 成年免费大片在线观看| 看十八女毛片水多多多| 一级片'在线观看视频| 熟女人妻精品中文字幕| 国产成人午夜福利电影在线观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| xxx大片免费视频| 亚洲色图综合在线观看| 精品久久久精品久久久| 国内精品宾馆在线| 亚洲最大成人手机在线| 免费黄色在线免费观看| 日本黄色片子视频| 看免费成人av毛片| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 老司机影院成人| 国产探花极品一区二区| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说 | av播播在线观看一区| 国产精品久久久久久av不卡| 国产成人精品一,二区| 日本色播在线视频| 亚洲综合精品二区| kizo精华| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 亚洲精品国产av蜜桃| 热re99久久精品国产66热6| 免费大片黄手机在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲人成网站在线播| 22中文网久久字幕| 国产免费一区二区三区四区乱码| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲欧美一区二区三区国产| av福利片在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 高清在线视频一区二区三区| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲综合精品二区| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲国产欧美在线一区| 成人亚洲精品av一区二区| 国产高潮美女av| 午夜福利视频精品| 久久久欧美国产精品| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 久久久亚洲精品成人影院| 午夜福利视频精品| 另类亚洲欧美激情| 一级毛片 在线播放| 久久久久性生活片| 波野结衣二区三区在线| 搡老乐熟女国产| 国产 一区 欧美 日韩| 少妇人妻一区二区三区视频| 国内精品宾馆在线| 国产成人精品福利久久| 国国产精品蜜臀av免费| 欧美高清性xxxxhd video| av网站免费在线观看视频| 男男h啪啪无遮挡| 欧美高清成人免费视频www| 99久久精品热视频| 欧美丝袜亚洲另类| 日韩欧美 国产精品| 一区二区三区四区激情视频| 一级av片app| 欧美激情国产日韩精品一区| 欧美精品国产亚洲| 国产美女午夜福利| 中国美白少妇内射xxxbb| av又黄又爽大尺度在线免费看| 婷婷色av中文字幕| av网站免费在线观看视频| 欧美成人a在线观看| 免费av观看视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 午夜精品国产一区二区电影 | 国产精品国产三级国产av玫瑰| 免费看日本二区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲无线观看免费| 亚洲av福利一区| 国产乱人偷精品视频| 成人黄色视频免费在线看| 下体分泌物呈黄色| 欧美区成人在线视频| 69人妻影院| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产成年人精品一区二区| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国内精品宾馆在线| 三级经典国产精品| 午夜亚洲福利在线播放| 久久久精品免费免费高清| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 久久精品人妻少妇| 日本一二三区视频观看| 熟女电影av网| 亚洲国产精品成人综合色| 中文资源天堂在线| 欧美国产精品一级二级三级 | 搡女人真爽免费视频火全软件| 麻豆精品久久久久久蜜桃| av在线蜜桃| 国模一区二区三区四区视频| 白带黄色成豆腐渣| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲欧美精品专区久久| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产精品久久久久久久电影| 欧美zozozo另类| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲精品国产色婷婷电影| 免费人成在线观看视频色| 免费电影在线观看免费观看| 欧美高清性xxxxhd video| 3wmmmm亚洲av在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 午夜日本视频在线| 亚洲人与动物交配视频| av在线蜜桃| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久女婷五月综合色啪小说 | 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 99久国产av精品国产电影| 亚洲成人av在线免费| 久久韩国三级中文字幕| 国产成人freesex在线| 校园人妻丝袜中文字幕| 99re6热这里在线精品视频| 99九九线精品视频在线观看视频| av专区在线播放| 精品久久久久久久久av| 国产欧美日韩精品一区二区| 日韩av免费高清视频| 精品一区二区三卡| 丰满人妻一区二区三区视频av| 高清在线视频一区二区三区| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲怡红院男人天堂| 亚洲国产精品国产精品| www.色视频.com| 亚洲人成网站在线播| 久久精品国产自在天天线| 丝瓜视频免费看黄片| 视频区图区小说| 特大巨黑吊av在线直播| 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美 日韩 精品 国产| 国产精品成人在线| 亚洲精品456在线播放app| 日本与韩国留学比较| 干丝袜人妻中文字幕| 久久99蜜桃精品久久| 国产视频内射| 久久99蜜桃精品久久| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲精品,欧美精品| 国产精品一二三区在线看| 国产精品成人在线| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久国产乱子免费精品| 香蕉精品网在线| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲av在线观看美女高潮| 日本wwww免费看| 国产日韩欧美亚洲二区| 高清日韩中文字幕在线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久久久久久久大av| 国产综合懂色| 亚洲av.av天堂| 真实男女啪啪啪动态图| 免费电影在线观看免费观看| 成人美女网站在线观看视频| 欧美精品国产亚洲| 久久久精品免费免费高清| 听说在线观看完整版免费高清| 97超碰精品成人国产| 男女边吃奶边做爰视频| av在线亚洲专区| 舔av片在线| 高清视频免费观看一区二区| 久久99热这里只频精品6学生| 成人午夜精彩视频在线观看|