三苯氧胺對(duì)晚期大腸癌多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用研究

梁孝印

多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是腫瘤化療失敗的重要原因，逆轉(zhuǎn)MDR在腫瘤化療中愈來(lái)愈顯得重要。MDR與多種因素密切相關(guān)，其中最重要的是MDR基因的過(guò)度表達(dá)與其編碼產(chǎn)物P-糖蛋白的增多。大腸癌早期診斷困難，且很多患者因健康狀況等原因而不能手術(shù)。逆轉(zhuǎn)化療中出現(xiàn)的MDR，對(duì)大腸癌患者顯得愈發(fā)重要。本研究通過(guò)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞膜P-gp含量，臨床篩選產(chǎn)生多藥耐藥的晚期大腸癌患者，對(duì)比觀察三苯氧胺預(yù)處理對(duì)FOLFOX4化療方案(奧沙利鉑聯(lián)合5-氟尿嘧啶/亞葉酸鈣)化療作用及外周血淋巴細(xì)胞膜P-gp含量的影響。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器 鼠抗人P-gp單克隆抗MRK16，免疫陰性對(duì)照抗體羊抗鼠IgG，及羊抗鼠IgG-FIFC(異硫氰酸熒光素標(biāo)記)，均購(gòu)自法國(guó)國(guó)際免疫公司;淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所;三苯氧胺為上海華聯(lián)制藥公司產(chǎn)品，奧沙利鉑及亞葉酸鈣由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，氟尿嘧啶由上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。LD4-2A型低速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠;FACScan型流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司。

1.2 試驗(yàn)樣本

1.2.1 臨床資料 62例大腸癌患者均為2009年6月至2010年8月在泰安市中心醫(yī)院經(jīng)病理學(xué)證實(shí)(手術(shù)或活檢)為大腸癌，均經(jīng)過(guò)3療程(含3療程)以上奧沙利鉑-氟尿嘧啶方案治療。所有病例入組前采外周靜脈血2 ml，分離淋巴細(xì)胞，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞膜 P-gp含量，表達(dá)陽(yáng)性患者入選。入選病例隨機(jī)分為三苯氧胺組33例和單純化療組29例。三苯氧胺組男20例，女13例，年齡33～76歲，中位年齡52歲;單純化療組男19例，女10例，年齡31～72歲，中位年齡49歲。P-gp正常對(duì)照組，選擇住院非惡性腫瘤患者30例，男19例，女11例，年齡21～76歲，中位年齡51歲，測(cè)定其淋巴細(xì)胞膜P-gp含量，計(jì)算P-gp表達(dá)陽(yáng)性界值。

1.2.2 標(biāo)本制備 外周血淋巴細(xì)胞提取及制備參見(jiàn)文獻(xiàn)［1］，取靜脈血2 ml，以2% 乙二胺四乙酸鈉(EDT A)抗凝(1∶9)，加入淋巴細(xì)胞分離液2 ml，以1500 r/min離心5 min，提取淋巴細(xì)胞，PBS漂洗，1500 r/min離心5 min，2次，去上清，70%乙醇固定。檢測(cè)前，先以PBS漂洗樣品懸液1次，1500 r/min離心5 min，除去固定劑，調(diào)整懸液細(xì)胞數(shù)在109/L左右，再將每份懸液分別加入兩試管中，其一加入 20 μl MRK16，其二加入20 μl羊抗鼠IgG(以排除非特異免疫反應(yīng)誤差)，室溫放置20 min，2000 r/min離心5 min，共3次，再向兩試管中分別加入20 μl羊抗鼠IgG-FIFC，室溫避光放置30 min，2000 r/min 離心5 min，3 次，PBS 漂洗，待檢。

1.3 外周血淋巴細(xì)胞膜P-gp含量檢測(cè) 用流式細(xì)胞儀收集2萬(wàn)個(gè)淋巴細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，在Macintosh 650型計(jì)算機(jī)上應(yīng)用Cell Ques Plot軟件(美國(guó)BD公司)分析數(shù)據(jù)結(jié)果。P-gp含量以P-gp陽(yáng)性細(xì)胞百分率表示，計(jì)算公式為：P-gp陽(yáng)性細(xì)胞%=P-gp陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/(P-gp陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)+P-gp陰性細(xì)胞數(shù)-非特異結(jié)合細(xì)胞)×100%。

P-gp陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：取正常人外周血淋巴細(xì)胞P-gp含量的95%可信限，即均值+標(biāo)準(zhǔn)差為界值×2，檢測(cè)值大于此值判斷為P-gp陽(yáng)性，小于或等于此值判斷為陰性［1］。

1.4 治療方法 三苯氧胺組于化療3 d前開(kāi)始口服三苯氧胺40 mg/d，隨后行草酸鉑(L-OHP)85 mg/m-2靜脈滴入，第1天;亞葉酸鈣(CF)200 mg/m2，靜脈滴注 2 h，第1～2天;CF后5-氟尿嘧啶(5-Fu)400 mg/m2快速靜脈推注，繼以5-Fu 600 mg/m2持續(xù)靜脈滴入22 h，第1～2天，2周為1個(gè)周期?；熃M不給予三苯氧胺，僅完成相同F(xiàn)OLFOX4方案化療。

1.5 臨床觀察及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 兩組病例均行化療4個(gè)周期后評(píng)價(jià)療效，化療結(jié)束后第2天采集血液樣本進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞膜 P-gp含量檢測(cè)。療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)按 WHO統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)［2］：療效分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)、進(jìn)展(PD);不良反應(yīng)分為 0～Ⅳ度。以CR+PR/總例數(shù)×100%計(jì)算有效率。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SAS軟件，計(jì)量資料應(yīng)用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，療效分析應(yīng)用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 正常人P-gp含量 正常人外周血淋巴細(xì)胞膜P-gp含量為(1.47% ±0.26)%，計(jì)算 P-gp陽(yáng)性界值：(1.47+0.26)%=1.99%，外周血淋巴細(xì)胞膜P-gp含量大于1.99%病例入選。

2.2 P-gp含量變化 兩組病例外周血淋巴細(xì)胞膜P-gp含量變化見(jiàn)表1。

表1 外周血淋巴細(xì)胞膜P-gp含量

2.3 P-gp轉(zhuǎn)陰率 外周血淋巴細(xì)胞膜P-gp轉(zhuǎn)陰率，單純化療組為7.00%，三苯氧胺組為36.00%。兩組比較，三苯氧胺組轉(zhuǎn)陰率明顯高于單純化療組，(P＜0.01)。

2.4 臨床療效 兩組臨床療效比較見(jiàn)表2。三苯氧胺組的總有效率、中位生存期和1年生存率都比單純化療組高，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 兩組臨床療效比較

2.5 毒性與不良反應(yīng) 兩組毒性與不良反應(yīng)基本相同。主要是血液學(xué)毒性及消化道反應(yīng)，但均為Ⅰ～Ш級(jí)，在所有病例中均未出現(xiàn)Ⅳ級(jí)。經(jīng)粒細(xì)胞集落刺激因子及TH-3受體阻斷劑對(duì)癥處理，所有患者均完成1～3療程化療。

3 討論

多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞由某一抗癌藥物誘發(fā)產(chǎn)生耐藥性，往往同時(shí)對(duì)其他化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的藥物產(chǎn)生交叉耐藥的一種現(xiàn)象［2］?；熀竽[瘤細(xì)胞產(chǎn)生的多藥耐藥(MDR)常使化療難以奏效并最終導(dǎo)致化療失敗。已證明MDR與P-糖蛋白(P-gp)高表達(dá)有關(guān)。P-gp陽(yáng)性表達(dá)于胰導(dǎo)管上皮，肝細(xì)胞的膽管面、小腸和大腸的腔膜面等，這些正常組織陽(yáng)性表達(dá)的主要作用是與拮抗外源性毒素、代謝產(chǎn)物的排泄以及增強(qiáng)細(xì)胞吞噬有關(guān)［3］。P-gp作為一種ATP酶活性的跨膜泵或“換位酶”，將進(jìn)入細(xì)胞的化療藥物泵出或使其外流，而維持細(xì)胞內(nèi)化療藥物的低濃度水平，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的多藥耐藥。P-gp不僅在腫瘤細(xì)胞膜上表達(dá)，人外周血淋巴細(xì)胞(如NK細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等)如長(zhǎng)期受某些化學(xué)藥物的作用，其細(xì)胞膜上P-gp表達(dá)也會(huì)顯著增加［4］。從而可以通過(guò)外周血淋巴細(xì)胞膜P-gp含量檢測(cè)腫瘤耐藥和尋找逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥藥物。

以P-gp及其他耐藥相關(guān)蛋白為作用靶點(diǎn)，篩選耐藥相關(guān)蛋白逆轉(zhuǎn)劑，找尋對(duì)耐藥腫瘤細(xì)胞有效的凋亡誘導(dǎo)劑，對(duì)腫瘤治療具有重要意義。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大劑量使用三苯氧胺可以獲得足夠濃度而能逆轉(zhuǎn)P-gp/mdr1介導(dǎo)的MDR［5］。裸鼠實(shí)驗(yàn)研究亦表明，體內(nèi)使用三苯氧胺能增強(qiáng)阿霉素的抑制腫瘤生長(zhǎng)作用，即可以逆轉(zhuǎn)其MDR表型，增加化療敏感性［6］。三苯氧胺可部分逆轉(zhuǎn)淋巴細(xì)胞mdr1表達(dá)陽(yáng)性的非小細(xì)胞肺癌患者多藥耐藥性，顯著提高EMP方案對(duì)耐藥的非小細(xì)胞肺癌患者的療效［1］。我們的實(shí)驗(yàn)表明，三苯氧胺能降低外周血淋巴細(xì)胞膜P-gp含量，提高外周血淋巴細(xì)胞膜P-gp轉(zhuǎn)陰率，提高化療總有效率，延長(zhǎng)生存期，是一有效的耐藥相關(guān)蛋白逆轉(zhuǎn)劑。

相信隨著人們對(duì)惡性腫瘤多藥耐藥機(jī)制及MDR逆轉(zhuǎn)劑的研究，必將會(huì)找到更多的辦法來(lái)克服腫瘤的耐藥性，更好地指導(dǎo)臨床化療，減少盲目性，提高預(yù)見(jiàn)性，為腫瘤的綜合治療找到更多的辦法。

［1］郭軍，王寶成，尹格平.三苯氧胺對(duì)淋巴細(xì)胞mdrl表達(dá)陽(yáng)性的非小細(xì)胞肺癌患者多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用.臨床腫瘤學(xué)雜志，1998，4(12)：19-22.

［2］BiedLer JL，Riehm H.Celluar resistance to actinomycin D in Chinese hemster cells in vitro：cross-resistance，radioautographic and cytogenetic studies.Cancer Res，1970，30(6)：1174-1184.

［3］穆寶忠，隋秀芳.腫瘤多藥耐藥基因p-糖蛋白及其耐藥逆轉(zhuǎn)的研究進(jìn)展. 臨床醫(yī)藥實(shí)踐，2010，19(4)：245-246.

［4］Chau dary PM，Mech etner EB，Ronins on IB.Expression and activity of the multidrug resistance P-gly coprotein in human peripheral blood lymphocytes.Blood，1992，80(11)：2735-2739.

［5］沈歷宗，吳文溪，武正炎.大腸癌多藥耐藥性研究進(jìn)展.國(guó)外醫(yī)學(xué)外科學(xué)分冊(cè)，1998，25(4)：218-222.

［6］沈歷宗，吳文溪.三苯氧胺逆轉(zhuǎn)大腸癌多藥耐藥性的研究.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2000，17(1)：65-66.