云南商品牛肝菌中易混淆毒牛肝系統(tǒng)學(xué)研究*

李樹紅 ，趙永昌 ，于富強 ，王向華 ，張小雷 ，劉培貴 **

（1.中國科學(xué)院昆明植物研究所，云南 昆明 650204；2.云南農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，云南 昆明 650223；3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650223）

商品牛肝菌（Commercial bolete）是泛指一類大型、肉質(zhì)、孔狀貿(mào)易菌類的名稱，但也包括部分具有褶狀、產(chǎn)褐色牛肝菌類孢子的傘狀高等菌物，如褶孔牛肝菌屬（Phylloporus Quél.）的種類等[1]。商品牛肝菌主要由可食牛肝菌組成，其中美味牛肝菌（Boletus edulis complex）是世界著名的美味野生食用菌之一，其它如雙色牛肝菌（B.bicolor Peck）、小美牛肝菌（B.speciosus Frost）、深褐牛肝菌（B.obscureumbrinus Hongo）、華麗牛肝菌（B.magnificus W.F.Chiu）、淡灰褐色網(wǎng)柄牛肝菌（Retiboletus griseus Frost）、美柄牛肝菌 （B.calopus Fr.）、茶褐牛肝菌 （B.brunneissimus W.F.Chiu）、 桃紅牛肝菌（B.regius Krombh.）、中華牛肝菌（B.sinicus W.F.Chiu）等是云南野生菌貿(mào)易市場上的優(yōu)勢種類[2-8]，在夏秋季是市場上非常普遍，深受當(dāng)?shù)厝罕娤矏邸?/p>

但不幸的是由于牛肝菌物種多樣性豐富，種間形態(tài)相似性高，形態(tài)學(xué)鑒定相對較困難，以及民間 “以貌擇食”的傳統(tǒng)習(xí)慣，導(dǎo)致食用牛肝菌中毒的事件頻繁發(fā)生。因此學(xué)術(shù)界和消費者一致要求探索新的方法來鑒定商品牛肝菌中的混淆毒菌。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，基因序列分析對比成為了現(xiàn)實，DNA序列分析技術(shù)在揭示大型真菌系統(tǒng)發(fā)育及物種鑒定方面受到重視，本研究也就是基于這樣的理論，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，應(yīng)用ITS序列對云南商品牛肝菌中易混淆毒菌展開分子系統(tǒng)學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

在野生菌出菇期赴野生菌主產(chǎn)區(qū)的交易市場采集商品牛肝菌及其易混淆毒菌，作為形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)研究材料。

1.1.2 顯微形態(tài)特征觀察使用的試劑

5%和10%氫氧化鉀試劑（KOH），1%剛果紅試劑（Congo Red），梅氏試劑（Melzer’s eagent），蒸餾水。

1.1.3 ITS序列擴增引物

本研究應(yīng)用通用引物ITS4和ITS5，對商品牛肝菌及易混淆毒菌的ITS序列進行擴增。引物堿基組成見表1。

表1 ITS區(qū)域PCR擴增采用的引物及堿基組成

1.1.4 GenBank中下載的ITS序列

為了加強對比，充分了解各物種種質(zhì)資源多樣性，構(gòu)建更加趨于自然的牛肝菌系統(tǒng)樹，在研究中從GenBank中下載了5條ITS序列，見表2。

表2 分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究中所用材料的GenBank序列號

1.2 方法

1.2.1 顯微形態(tài)特征的研究

顯微觀察是形態(tài)分類的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是構(gòu)建系統(tǒng)學(xué)及分子檢測研究的基礎(chǔ)，本研究應(yīng)用現(xiàn)代真菌分類學(xué)方法對收集標(biāo)本進行研究。

1.2.2 DNA提取

CTAB法[9，10]。選取無蟲蛀的大型真菌的干樣，取適量菌肉，液氮磨碎；加入700 μL 65℃預(yù)熱的DNA提取緩沖液，輕輕振蕩混勻，65℃水浴30 min，期間混勻2次～3次； 加入 230 μL 5 mmol·L-1KAc，冰浴 20 min； 等體積的氯仿:異戊醇（24:1） 抽提 1 次（10000 r·min-1，4℃離心10 min）取上清，加入2/3倍體積的-20℃預(yù)冷異丙醇，混勻，-20℃靜置約 30 min； 離心（8000 r·min-1，4℃離心 8 min），倒去上清液，用80%乙醇和無水乙醇各漂洗1次，晾干， 加入 500 μL TE buffer溶液；加入 20 μL RNAase（1 mg·mL-1），37℃溫浴 1 h； 加等體積酚（pH8.0） ∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1） 和氯仿∶異戊醇 (24∶1) 各抽提1次（10000 r·min-1，4℃離心 10 min）； 取上清液，加入2/3倍體積的異丙醇輕搖，沉淀過夜；離心（10000 r·min-1，4℃離心10 min）；沉淀用80%乙醇漂洗，晾干，溶于30 μL TE buffer溶液中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴增反應(yīng)體系

PCR擴增反應(yīng)體系選用50 μL反應(yīng)體系，其中包括10×擴增緩沖液（含 MgCl2） 5 μL，200 μmol·L-1dNTP 5 μL，5 μmol·L-1的引物各 1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.6 μL（2.5 μ·μL-1），DNA 模板 1 μL（量的多少因 DNA 濃度而異），用 ddH2O 定容至 50 μL。

1.2.4 PCR擴增反應(yīng)程序

PCR擴增反應(yīng)程序的熱循環(huán)參數(shù)：94℃變性5 min，然后進入連續(xù)35個循環(huán)（94℃變性0.5 min，56℃退火0.4 min，72℃延伸 0.4 min）， 循環(huán)結(jié)束后于 72℃延伸 5 min，最后于4℃保存。

1.2.5 PCR擴增產(chǎn)物檢測

分別取2 μL PCR產(chǎn)物和Marker與2 μL溴酚藍混勻，點樣于1%的瓊脂凝膠上，于1.0×TAE緩沖液中電泳30 min后，再在紫外線凝膠成像儀上觀察、照相并記錄結(jié)果。

1.2.6 PCR擴增反應(yīng)產(chǎn)物測序及序列比對

PCR擴增產(chǎn)物送上海生工膠回收后測序，測序引物與PCR擴增引物相同。對所得到的序列對照測序的峰形圖，仔細核查每一個堿基以確保其準(zhǔn)確性。如果同一序列是用不同引物進行擴增，則用SeqMan軟件將這些序列進行拼接后再進行比對。將從GenBank中得到的序列與本研究中所測的序列用ClustalX 2.1進行序列比對，確定序列邊界，構(gòu)造矩陣后再進行手工調(diào)整以保證對應(yīng)堿基的同源性，比對完畢后采用PAUP 4.0進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.7 DNA序列分析

最大簡約性分析（Most Parsimony，MP）

2 研究結(jié)果與分析

2.1 基于ITS序列構(gòu)建的云南商品牛肝菌及其易混淆毒菌的最大簡約樹

ITS具有進化速度快、易擴增、GenBank中數(shù)據(jù)信息豐富等優(yōu)點，所以常被研究者用來構(gòu)建物種系統(tǒng)樹，闡釋物種間的親緣關(guān)系以及物種的鑒定。本研究用于分析的ITS序列有64條，其中5條為GenBank中下載獲得（表2、 圖 1）。

圖1 基于ITS序列構(gòu)建的云南商品牛肝菌及其易混淆毒菌7棵最大簡約樹之一

根據(jù)系統(tǒng)樹的拓撲結(jié)構(gòu)，云南商品牛肝菌及其易混淆毒菌形成5個較大的分支。Clade I中的種是云南鮮菇市場和干片商品中易見的混雜種類，涉及裘氏牛肝菌屬[10]、圓孔牛肝菌屬、條孢牛肝菌屬、金牛肝菌屬、松塔牛肝菌屬和牛肝菌屬共6個屬，這6個屬，除了牛肝菌屬外，其余5個屬的牛肝菌資源在地方上，沒有人將新鮮子實體直接炒食，老百姓都說有毒，其中Subclade I是最大的混雜類群，流入市場的主要原因是綠蓋裘氏牛肝菌資源量豐富，采集容易，加之當(dāng)?shù)乩相l(xiāng)認為鮮食有毒，但加工成干片，可以去掉毒素；其次SubcladeⅡ中的亞絨蓋牛肝菌（B.subtomentosus）是否有毒說法不一，市場上少見新鮮子實體出售，此菌在各地沒有人鮮食，一般主要以干片的形式混雜于小美牛肝菌和美柄牛肝菌中出售；另外，Subclade III中的混淆松塔牛肝菌（Strobilomyces confusus）也主要以干片混雜出售。CladeⅡ分支中的牛肝菌種類主要以內(nèi)銷為主，如雙色牛肝菌（B.bicolor）是品質(zhì)優(yōu)良的食用菌，市場價值高，茶褐牛肝菌（B.brunneissimus）是滇中地區(qū)商品量較大的食用菌；在這個分支中也存在一些食毒說法不一的種類[1，11，12]，如赭黃牛肝菌 （B.luridus） 和紅柄牛肝菌（B.erythropus）。Clade III分支中涉及到的種類是屬于美味牛肝菌復(fù)合群，產(chǎn)量大，市場價值高，在采集和銷售中往往當(dāng)作美味牛肝菌一個種來處理。在Clade IV中，紫牛肝菌（B.violaceo-fuscus）的食用性存在爭議，在一些地區(qū)（如宜良縣）老百姓說是毒菌，不宜采食，而在另一些地區(qū)（如南華縣）有人認為可食，但未見單獨加工食用，常常是采集或收購加工成干片后混雜于其它牛肝菌中銷售。另外，紫牛肝菌（B.violaceo-fuscus）與牛肝菌屬（Boletus）其它種的親緣關(guān)系較遠，所以紫牛肝菌是否屬于牛肝菌屬值得進一步研究。CladeⅤ中涉及的種，主要用于鹽漬或干片，特別是小孢粉孢牛肝菌（T.microsporus）量大[10]，價格便宜，但在當(dāng)?shù)貨]人食用。

2.2 云南商品牛肝菌中易混淆毒菌種類

云南多元的立體氣候，為各種牛肝菌的生長提供了良好的生境，培育了繁榮的野生菌市場，經(jīng)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)結(jié)合研究發(fā)現(xiàn)，云南商品牛肝菌資源量大，約占野生菌交易量的1/3；物種多樣性豐富，至少涉及16個屬；市場上常見易混淆的有毒牛肝菌有綠蓋粉孢牛肝菌（Chiua virens）、圓花孢牛肝菌（Heimioporus retisporus）、黃粉末牛肝菌（Pulveroboletus ravenelii）、紫蓋牛肝菌（Tylopilus eximius）和小孢粉孢牛肝菌（Tylopilusmicrosporus）共5種。

3 討論

云南特殊的生境資源，孕育了豐富的大型真菌資源。種類多、生態(tài)復(fù)雜使得云南牛肝菌生物多樣性豐富，種間形態(tài)相似性較高，這給采菌者和消費者正確識別帶來較大困難。目前，國內(nèi)外還沒有一種科學(xué)快速鑒定或檢測所采或所食牛肝菌是否為毒菌的方法或技術(shù)，所以人們判斷一種牛肝菌是否有毒的主要依據(jù)來源于文獻和當(dāng)?shù)赜胁删?jīng)驗者的認識。但是，有時不同文獻對同一物種的可食性報道說法不一致，導(dǎo)致在信息的取舍上難以抉擇；有時還出現(xiàn)文獻之間[2，12]、文獻與實際食用之間矛盾的情況，如美柄牛肝菌（B.calopus）和小美牛肝菌（B.speciosus）文獻報道有毒，而這兩個種市場量大，消費人群廣，老百姓和消費者都說是安全的無毒菌，另外，老百姓 “以貌擇食”的傳統(tǒng)識別方法對某一種毒菌可以，但不能用作區(qū)分所有毒菌的一般規(guī)律，如雙色牛肝菌顏色艷麗卻是美味食用菌，而小孢粉孢牛肝菌顏色普通則為毒菌。

從以上的分析可以看出，目前尚無統(tǒng)一或簡單有效識別毒牛肝菌的方法，這給牛肝菌可食性判斷帶來很大影響，特別是市場上的少見種，因此在確定某一種牛肝菌是否可食時，必須多走訪調(diào)查有采集經(jīng)驗的人，經(jīng)他們確認可食時，方可確認無毒。

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