蛹蟲草繼代培養(yǎng)后主要生物學性狀的變化*

王 熙，張 佳，張國珍

（中國農(nóng)業(yè)大學植物病理學系，農(nóng)業(yè)部植物病理學重點實驗室，北京 100193）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又稱北冬蟲夏草、北蟲草等，是一種蟲生藥用真菌，為我國名貴的中藥材之一，具有很高的藥用價值和營養(yǎng)價值。蛹蟲草在自然界有著廣泛的分布，但自然資源匱乏，遠不能滿足人們的需求[1]。因此，如何高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)地人工培養(yǎng)蛹蟲草顯得尤為重要。目前，蛹蟲草的栽培方式主要是在固體培養(yǎng)基上接種或在昆蟲活蛹上接種蛹蟲草，在一定溫度、濕度和光照條件下培養(yǎng)后收獲子實體[2-4]。子實體是蛹蟲草的藥用部位，也是有性生殖的產(chǎn)物。已有研究表明蛹蟲草為異宗配合真菌[5]，即需要2個相反交配型（MAT-1、MAT-2）的菌株才能完成有性生殖，產(chǎn)生子實體。子實體的產(chǎn)生除了與交配型基因有關外，還與栽培過程中的外界環(huán)境條件有關。為了促進子實體的形成，提高蛹蟲草的產(chǎn)量，可以從選種、培養(yǎng)料配制以及栽培條件和技術等的改進來提高產(chǎn)量[6-8]。與其他絲狀真菌相似，蛹蟲草在培養(yǎng)過程中其生物學性狀會發(fā)生一些變化，如菌種 “退化”[3]、發(fā)生菌落角突變和子實體產(chǎn)量下降[9]等。本研究組對蛹蟲草有性孢子的萌發(fā)過程和有性后代群體的培養(yǎng)性狀進行了觀察[10]。但是，對于蛹蟲草菌株尤其是來自有性后代子囊孢子的菌株，在繼代培養(yǎng)過程中其生物學性狀的變化缺乏系統(tǒng)觀察和研究。本試驗的目的是研究蛹蟲草不同菌株經(jīng)多次繼代培養(yǎng)后，在菌落性狀、生長速率、產(chǎn)孢量以及子實體形成等生物學性狀方面會發(fā)生哪些變化，以便為深入研究菌株退化問題提供一定的線索。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

根據(jù)菌株來源、菌落特征等，本試驗選取了4個單子囊孢子菌株和1個組織分離的菌株，其中2個單子囊孢子菌株分離自野生蛹蟲草子實體，2個單子囊孢子菌株分離自人工培養(yǎng)的子實體，5株代表菌株的信息見表1。

表1 供試菌株的交配型、菌落性狀及其來源

4個單子囊孢子菌株單獨培養(yǎng)時均不能形成子實體，組織分離的菌株可以形成子實體。單子囊孢子菌株的分離參照梁月等[10]的方法。交配型的確定采用分子生物學方法（專利號： 200910085789.4）。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

單子囊孢子的分離使用2.0%水瓊脂培養(yǎng)基，菌株的培養(yǎng)使用改良的PDA培養(yǎng)基，改良PDB液體培養(yǎng)基用于子實體形成試驗中接種體的制備，子實體形成試驗所用培養(yǎng)基為大米培養(yǎng)基，參照梁月等[10]的方法進行。

1.3 菌絲生長速率測定及菌落形態(tài)的觀察

將供試菌株在改良PDA培養(yǎng)基上于21℃、光照條件下培養(yǎng)，至菌落將要長滿6 cm培養(yǎng)皿時，用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，定量接種至新的改良PDA培養(yǎng)基上，同樣條件下培養(yǎng)15 d，記為第1代菌株，用同樣的方法進行繼代培養(yǎng)，每培養(yǎng)15 d為1代。在培養(yǎng)過程中，每天測量菌落直徑，取15 d的平均值為當代的平均菌絲生長速率。同時，觀察菌落的顏色與質(zhì)地。每個菌株每代重復3皿。

分離自野生子實體的2個菌株已培養(yǎng)至第18代，來自于人工栽培子實體的3個菌株已培養(yǎng)至第11代。

1.4 產(chǎn)孢量的測定

將菌株按方法1.3培養(yǎng)15 d，在菌落半徑1/2處用8 mm打孔器打取3個菌餅，放入10 mL 0.45‰吐溫水溶液中，用振蕩器震蕩1 min后制成分生孢子懸浮液，稀釋后用血球計數(shù)板計數(shù)分生孢子的濃度，最終換算成單位菌落面積的孢子數(shù)（個·cm-2）。每隔5代測定1次菌株的產(chǎn)孢量。每個菌株重復3皿。

1.5 子實體形成能力的測定

用PDB液體培養(yǎng)基洗下平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)的孢子和菌絲，取1 mL接種到含有40 mLPDB培養(yǎng)基的三角瓶中，搖床培養(yǎng)3 d～4 d后，接種到大米培養(yǎng)基上培養(yǎng)。45 d后觀察子實體的產(chǎn)生情況并稱重。每隔5代進行1次子實體產(chǎn)生試驗，每個菌株重復4次。

2 結(jié)果與分析

2.1 繼代培養(yǎng)過程中菌絲生長速率的變化

繼代培養(yǎng)過程中菌絲生長速率的變化情況見圖1。

圖1 蛹蟲草不同菌株繼代培養(yǎng)過程中生長速率變化

5個菌株的菌絲生長速率有一定差異，來自于野生子實體的2個菌株09-40-4和09-40-5，在第7代之前生長速率有一定波動，之后有比較明顯的下降，第18代的生長速率與第1代相比分別下降了19%和27%；來自于人工栽培子實體的2個菌株5E-10-2和5E-10-7，在第2代之后生長速率就有明顯的下降，第11代的生長速率與第1代相比分別下降了21%和19%，而組織分離的菌株5E-10-Z2生長速率在第5代之后開始下降，第11代的生長速率比第1代下降了6.2%?？傮w來看，隨著繼代培養(yǎng)代數(shù)的增加，各菌株的菌絲生長速率呈明顯下降的趨勢，來自于野生子實體的菌株表現(xiàn)生長速率下降的時間，比來自人工栽培子實體的菌株要慢。

2.2 繼代培養(yǎng)過程中菌落形態(tài)的變化

繼代培養(yǎng)過程中菌落形態(tài)的變化情況見圖2。

圖2 蛹蟲草不同菌株繼代培養(yǎng)過程中菌落形態(tài)變化（以09-40-4為例）

供試的5個菌株在繼代培養(yǎng)過程中菌落形態(tài)都發(fā)生了明顯的改變，主要表現(xiàn)為菌落顏色逐漸變淡和出現(xiàn)角突變。菌落顏色由橙色變成杏黃色或是由杏黃色變成淡檸檬黃色，特別是粉狀菌株在培養(yǎng)5代之后菌落邊緣開始形成白色絨狀的角突變。而菌落質(zhì)地沒有發(fā)生明顯變化。

2.3 繼代培養(yǎng)過程中菌株產(chǎn)孢量的變化情況

繼代培養(yǎng)過程中菌株產(chǎn)孢量的變化情況見圖3。

圖3 蛹蟲草不同菌株繼代過程中產(chǎn)孢量的變化

來自于野生子實體的2個菌株在第1代時產(chǎn)孢量很大，但第5代時產(chǎn)孢量明顯下降，之后隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加繼續(xù)減少，09-40-4和09-40-5第15代的產(chǎn)孢量與第1代相比分別下降了約88%和97%；來自于人工栽培子實體上的3個菌株，在培養(yǎng)過程中也出現(xiàn)了產(chǎn)孢量減少的情況，5E-10-2、5E-10-7以及5E-10-Z2第10代產(chǎn)孢量與第1代相比分別下降了約55%、67%和42%。

2.4 繼代過程中菌株子實體產(chǎn)生能力的變化情況

繼代過程中菌株子實體產(chǎn)生能力的變化情況見表2、圖4。

表2 供試菌株不同培養(yǎng)代數(shù)的子實體產(chǎn)生情況（鮮重）

圖4 蛹蟲草菌株繼代過程中子實體形成能力的變化情況（以 09-40-4×09-40-5 為例）

將培養(yǎng)1代后的2個相反交配型的菌株進行配對或?qū)⒔M織分離的菌株單獨培養(yǎng)，都能夠產(chǎn)生正常的子實體，產(chǎn)量也較高（表2），但培養(yǎng)5代后的菌株組合09-40-4與09-40-5的子實體產(chǎn)生明顯下降，或有些子實體發(fā)育不良，子實體上沒有子囊殼（圖4B），另一對菌株組合5E-10-2與5E-10-7甚至不產(chǎn)生子實體。培養(yǎng)第10代后的菌株全部喪失了產(chǎn)生子實體的能力，只長有類似于子實體原基的菌絲體（圖4C）。

3 討論

本研究除了1株組織分離的菌株外，其余4個菌株均是單子囊孢子的菌株，保證了初始菌株在遺傳上的單一。根據(jù)本試驗的觀察，隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，蛹蟲草的生物學性狀發(fā)生了明顯的改變，包括菌絲生長速率短暫升高之后逐步下降，菌落顏色逐漸變淡并有角突變出現(xiàn)，菌株產(chǎn)孢能力明顯減弱，子實體形成能力也逐漸減弱，由子實體產(chǎn)量減少發(fā)展為不能形成子實體。當然不同菌株生物學性狀發(fā)生改變的程度是有差異的，如菌株09-40-4和09-40-5配對相對比5E-10-2和5E-10-7配對所表現(xiàn)的 “退化”程度慢（表2）。因此，在實際生產(chǎn)中應該注重優(yōu)良菌株的選擇和保藏，并盡量減少菌種在人工培養(yǎng)基上的培養(yǎng)代數(shù)，以防止或減緩菌種的 “退化”。蛹蟲草菌株在培養(yǎng)過程中除了上述生物學性狀的變化外，還表現(xiàn)在退化菌株的脫氫酶活性和在色度培養(yǎng)基中的脫色能力都明顯比正常菌株減弱[11]。但對于繼代培養(yǎng)過程中菌株生物學性狀的變化尤其是子實體形成能力 “退化”的機制還有待進一步深入研究。

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