大蒜素對(duì)白色念珠菌感染的免疫抑制小鼠IL-4和IgG產(chǎn)生水平的影響

胡國(guó)偉，董 群

(皖南醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

白色念珠菌是醫(yī)院真菌感染最常見的致病菌，可引起人類皮膚黏膜、內(nèi)臟各系統(tǒng)感染。近年來(lái)，由于免疫抑制劑的大量應(yīng)用，腫瘤放療、化療、侵入性治療、器官移植的開展，以及濫用廣譜抗生素導(dǎo)致的菌群失調(diào)，白色念珠菌的感染率較以往有明顯增加［1］。目前，治療深部真菌感染藥物為化學(xué)性藥物，但在長(zhǎng)期治療和重復(fù)給藥過(guò)程中容易引起耐藥菌株的出現(xiàn)，而且具有不同程度的副作用。實(shí)驗(yàn)證明大蒜素具有廣譜抗微生物的活性，包括抗細(xì)菌活性、抗真菌活性，尤其抗白色念珠菌具有抗寄生蟲和抗病毒的活性［2，3］。我們通過(guò)觀察大蒜素對(duì)白色念珠菌感染模型鼠脾細(xì)胞IL-4、血清IgG產(chǎn)生水平的影響，進(jìn)一步探討其預(yù)防和治療白色念珠菌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康BALB/C雄性小鼠30只，6～8周齡，體量20～22 g，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(蘇)2008.0010。

1.1.2 供試菌株 本實(shí)驗(yàn)使用的白色念珠菌(Candida.Albicans，C.albicans)標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自廣州市微生物研究所。

1.1.3 藥物及試劑 大蒜素膠囊購(gòu)自江蘇正大清江制藥有限公司;環(huán)磷酰胺購(gòu)自山西普德藥業(yè)有限公司;小鼠IgG檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;小鼠IL-4試劑盒購(gòu)自南京欣博盛生物科技發(fā)展有限公司;Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自大連寶生物科技發(fā)展有限公司;引物1，2［4］:根據(jù)真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)設(shè)計(jì)通用引物一對(duì)，由大連寶生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，ITS1:5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'，ITS4:5'-tcctccgcttattgatatgc-3'。

1.1.4 儀器 二氧化碳(CO2)恒溫培養(yǎng)箱(上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠，型號(hào):TC 2323型);酶標(biāo)儀(鄭州博塞生物工程有限責(zé)任公司，型號(hào):2000型);高速冷凍離心機(jī)(上海良平儀器儀表有限公司);PCR儀(英國(guó)Techne公司)，Gel Doc1000凝膠成像系統(tǒng)(Bio Rad公司)，電泳儀(Bio Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 白色念珠菌培養(yǎng)及菌液的制備 將白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種到改良沙氏(Sabourand's)固體培養(yǎng)基上(1 L蒸餾水中加入葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，瓊脂18 g，高壓滅菌112℃ 15 min，待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)加入青霉素20 U/ml，鏈霉素40 U/ml)，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，經(jīng)無(wú)菌生理鹽水洗下制成菌懸液，血球計(jì)數(shù)板調(diào)整菌液濃度為2×107/ml，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小鼠免疫力低下模型的建立［5］30只小鼠實(shí)驗(yàn)前3 d腹腔一次性注射環(huán)磷酰胺200 mg/kg，每只0.2 ml，制備免疫力低下小鼠模型。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將30只免疫力低下小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。預(yù)防組小鼠每天灌服1次 25 mg/(kg·d)大蒜素 0.4 ml×7 d，其余兩組灌服等量生理鹽水7 d;第8天各組小鼠尾靜脈接種2×107/ml白色念珠菌菌液0.2 ml，同時(shí)給予預(yù)防組和治療組分別灌服25 mg/(kg·d)大蒜素0.4 ml×7 d，感染組灌服等量生理鹽水7 d。

1.2.4 小鼠脾細(xì)胞懸液的制備 無(wú)菌取出各組脾臟。將脾臟置入無(wú)菌平皿中的不銹鋼篩網(wǎng)(100目/cm2)上，加入5 ml Hanks液，用玻璃注射器針芯充分研磨，經(jīng)網(wǎng)制成單細(xì)胞懸液，1 000 rpm離心10 min，棄上清，加Tris-NH4Cl 2 ml吹打去除紅細(xì)胞，不完全RPMI-1640液洗2次，再用完全RPMI-1640液充分重懸細(xì)胞，即為脾細(xì)胞懸液。

1.2.5 用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定小鼠脾細(xì)胞懸液IL-4水平以及血清IgG的水平 具體操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書程序進(jìn)行。

1.2.6 白色念珠菌DNA的抽提 各組小鼠于尾靜脈注入白色念珠菌液次日分別摘眼球取血，嚴(yán)格按照Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取DNA。

1.2.7 白色念珠菌引物擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn) 用設(shè)計(jì)的白色念珠菌引物對(duì)各樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增并均采用50 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為:10×反應(yīng)緩沖液5 μl;DNA 模板 2 μl;Taq 酶(5 U/μl)0.2 μl;dNTP mixture(2.5 mmol/L)4 μl;引物各 2 μl;其余為雙蒸水。PCR條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸7 min，35個(gè)循環(huán);反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物于4℃保存，等待電泳。

1.2.8 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè) 取各擴(kuò)增產(chǎn)物8 μl與2 μl上樣緩沖液(4∶1)混勻后，依次點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠上(含 EB 0.5 μg/ml)，在1×TAE 電泳緩沖液中進(jìn)行電泳，以DL-2000為分子量標(biāo)準(zhǔn)，5 V/cm電壓電泳。當(dāng)溴酚蘭至適當(dāng)位置后，切斷電源，在紫外線和BIO-RAD凝膠成像分析系統(tǒng)上進(jìn)行分析和拍照。

2 結(jié)果

2.1 免疫抑制模型小鼠的建立 小鼠經(jīng)注射環(huán)磷酰胺后均無(wú)自然死亡現(xiàn)象，次日各組小鼠出現(xiàn)喜靜、少動(dòng)、飲食明顯減少、多尿、皮毛欠光滑等現(xiàn)象，與臨床上免疫力低下患者納差、消瘦、懶動(dòng)乏力等癥狀相似。

2.2 白色念珠菌感染模型鼠的建立 無(wú)菌條件下，取出各組小鼠的血液標(biāo)本。按照前述的方法，分離、抽提白色念珠菌DNA和PCR擴(kuò)增，于1%瓊脂糖凝膠上檢測(cè)。結(jié)果顯示除陰性對(duì)照未見條帶外，其余各樣本均可擴(kuò)增出分子量大小約為500 bp特異性條帶。見圖1～3。

圖1 預(yù)防組小鼠PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig 1 Eelectropherogram of PCR products in preventive group

圖2 治療組小鼠PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig 2 Eelectropherogram of PCR products in treatment group

圖3 感染組小鼠PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig 3 Eelectropherogram of PCR products in infective group

2.3 小鼠脾細(xì)胞懸液IL-4水平 由表1可見，預(yù)防組與感染組比較，IL-4水平增高顯著，兩組之間差異顯著(P＜0.01)。治療組與感染組比較，IL-4水平增高顯著，兩組之間差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。預(yù)防組和治療組之間IL-4水平比較，也有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 各組小鼠脾細(xì)胞懸液IL-4水平(±s)Tab 1 IL-4 level of cultural liquid of spleen cells for each group(±s)

表1 各組小鼠脾細(xì)胞懸液IL-4水平(±s)Tab 1 IL-4 level of cultural liquid of spleen cells for each group(±s)

兩兩比較采用q檢驗(yàn)，兩組間字母不同表示P＜0.05;兩組間字母相同表示P﹥0.05

組別 n IL-4表達(dá)水平(pg/ml) F值 P值預(yù)防組 10 26.51 ±1.45a治療組 10 17.29±1.23b 405.70 ＜0.01感染組 10 10.45 ±1.09c

2.4 小鼠血清IgG水平 由表2可見，預(yù)防組與感染組比較，IgG水平增高顯著，兩組之間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。治療組與感染組比較，IgG水平增高顯著，兩組之間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。預(yù)防組和治療組之間IgG水平比較，也有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表2 各組小鼠血清IgG水平(±s)Tab 2 Serum level of IgG for each group(±s)

表2 各組小鼠血清IgG水平(±s)Tab 2 Serum level of IgG for each group(±s)

兩兩比較采用q檢驗(yàn)，兩組間字母不同表示P＜0.05;兩組間字母相同表示P＞0.05

組別 n IgG表達(dá)水平(pg/ml) F值 P值預(yù)防組 10 0.2106 ±0.0248a治療組 10 0.1589±0.0158b 54.05 ＜0.01感染組 10 0.1169 ±0.0145c

3 討論

白色念珠菌是寄居在正常人體消化道、呼吸道和女性生殖道黏膜的正常菌群，一般不致病，僅在長(zhǎng)期的粒細(xì)胞減少、血液系統(tǒng)惡性腫瘤、長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、骨髓移植或?qū)嶓w器官移植及AIDS等情況下致機(jī)體免疫力減弱時(shí)，大量白色念珠菌的入侵可能發(fā)病。有資料表明應(yīng)用生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(Biological Response Modifer，BRM)防治深部真菌感染是可行的方法。傳統(tǒng)BRM如BCG、IL2、轉(zhuǎn)移因子等均存在著程度不同的毒副作用及價(jià)格較昂貴等缺點(diǎn)，使之在臨床應(yīng)用上受到一定的限制。而大蒜是百合科蔥屬植物蒜地下鱗莖，主要功效成分是蒜氨酸，具有廣譜抗菌消炎作用，我室前期的研究［6～9］已證實(shí)其具有提高機(jī)體細(xì)胞免疫功能等作用，但對(duì)體液免疫功能有無(wú)影響尚不知。

IgG是體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的一種最主要保護(hù)性抗體，血清中含量最高，半衰期長(zhǎng)，在機(jī)體防御機(jī)制中發(fā)揮抗感染、中和毒素及調(diào)理作用，且有保護(hù)黏膜的作用［10］。IL-4由T細(xì)胞產(chǎn)生能促進(jìn)B細(xì)胞的增殖、分化和抗體的生成，可增強(qiáng)B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答，因此，IL-4又稱B細(xì)胞生長(zhǎng)因子(B cell growth factor，BGCF)。本實(shí)驗(yàn)將大蒜素經(jīng)口灌服小鼠，觀察體液中IgG、IL-4含量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大蒜素能提高治療組和預(yù)防組小鼠IgG和IL-4水平，尤以預(yù)防組的效果最明顯，提示大蒜素亦可增強(qiáng)體液免疫功能。

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